Молодежный инновационный вестник

2415-7805

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный медицинский университет имени Н.Н. Бурденко" Министерства здравоохранения Российской Федерации

9740

Conference Proceedings

Evaluation of blood uric acid levels in mice with CRISPR-induced mutation of the Hprt1 gene

Kurbatova

Alexsandra Andreyevna

alexandrakurbatova03@gmail.comhttps://orcid.org/0009-0005-4658-507XZhunusov

Nikita Sergeevich

Research assistant in the Laboratory of Genetic Technologies and Gene Editing for Biomedicine and Veterinarynzhunu@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1969-3615Osipyan

Sergey Igorevich

osipyansergey23@gmail.comhttps://orcid.org/0009-0008-4837-3507Zelentsova

Alexsandra Sergeevna

Research assistant in the Laboratory of Genetic Technologies and Gene Editing for Biomedicine and Veterinaryzelentsova@bsu.edu.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6022-0206Skorkina

Marina Yuryevna

<pre id="tw-target-text" class="tw-data-text tw-text-large tw-ta" data-placeholder="Перевод" data-ved="2ahUKEwjjkrLVoLqEAxUAPxAIHfXOALAQ3ewLegQIDRAU">Senior Researcher in the Laboratory of Genetic Technologies and Gene Editing for Biomedicine and Veterinary</pre>marinaskorkina0077@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-9441-5295

Belgorod State National Research University

19042024

13S1232234

20022024

17042024

2024

Abstract. The assessment of changes in uric acid levels in an animal model of the orphan disease Lesch-Nyhan allows characterization of the personalized model from the perspective of the principal diagnostic criterion of this syndrome. The objective is to comparatively evaluate the dynamics of uric acid level changes in the blood plasma of mice with a mutation in the Hprt1 gene. Materials and Methods. The study utilized Hprt1del8Val mice of both genders, categorized into groups corresponding to the zygosity of the mutation on the X-chromosome: Hemi (hemizygous males), Homo (homozygous females), Het (heterozygous females), WT (wild-type animals of both genders). Blood samples were collected from the cheek of animals at various age intervals, starting from 5 weeks of age up to 15 weeks. Uric acid content analysis was conducted using an enzymatic method with spectrophotometric detection at a wavelength of 513 nm. The raw data were statistically processed, employing an appropriate significance criterion. Results. The uric acid level significantly differed in Hemi group males compared to WT group males at 5, 9, and 13 weeks by 21.1%, 21.79%, and 28.84%, respectively (p0.05). In females, significant differences in uric acid levels were observed in the Homo group at 5, 6, 10, and 15 weeks by 59.78%, 60.45%, 10.33%, and 37.33%, respectively (p0.05); and in the Het group by 45.01%, 61.68%, 22.05%, and 44.53%, respectively, compared to the control (p0.05). Conclusion. Hprt1del8Val mice differ from wild-type mice based on the main diagnostic criterion for Lesch-Nyhan syndrome, directly associated with the impairment of HPRT enzyme function. This personalized mouse model is a crucial component in studying metabolic disturbances occurring in Lesch-Nyhan syndrome.

Lesch-Nyhan SyndromeHprt1uric acidorphan diseases

Синдром Лёша-НиханаHPRTмочевая кислотаорфанные заболевания

Введение. Синдром Леша-Нихана (LND) представляет собой тяжелое неврологическое расстройство, вызванное мутациями в гене, кодирующем гипоксантин-гуанозин фосфорибозилтрансферазу (HPRT) [1]. Это редкое Х-сцепленное рецессивное заболевание. Как правило, поражаются мужчины, а гетерозиготные женщины являются носителями (обычно бессимптомными) [2]. Наблюдаемый при данном заболевании дефицит фермента HGprt приводит к характерному нейроповеденческому фенотипу, в котором преобладают дистония, умственная отсталость и недееспособное поведение, приводящее к самоповреждению. [3]. У всех пораженных лиц наблюдается избыточная выработка мочевой кислоты, что увеличивает риск образования камней в почках, почечной недостаточности и подагрического артрита. Аллопуринол эффективно снижает уровень мочевой кислоты для предотвращения почечных осложнений, но не оказывает влияния на поведение [4]. Известно, что синдром характеризуется дисфункцией дофаминовых нейронов среднего мозга, его структурных повреждений при этом не наблюдается. Данное явление связывается с тем, что дефицит HGprt вызывает специфические нарушения развития нервной системы во время эмбриогенеза, особенно влияя на пролиферацию и миграцию развивающихся дофаминовых нейронов среднего мозга (mDA) [5] Распространенность синдрома Леша-Нихана составляет 1-9/1 000 000, а предполагаемая распространенность при рождении составляет от 1/380 000 до 1/235 000 живорождений [2]. Фермент HPRT необходим для эффективной переработки пуриновых нуклеотидов. Он катализирует восстановительный синтез инозинмонофосфата (IMP) и гуанозинмонофосфата (GMP) из пуриновых оснований гипоксантина и гуанина соответственно, используя 5'-фосфорибозил-1-пирофосфат (PRPP) в качестве сооснования. Дефект HPRT приводит к накоплению его субстратов, гипоксантина и гуанина, которые превращаются в мочевую кислоту (UA) с помощью ксантиноксидазы [6]. Целью работы Сравнительная оценка динамики изменения уровня мочевой кислоты в плазме крови мышей с мутацией гена Hprt1. Материалы и методы исследования. В эксперименте использовали мышей линии Hprt1del8Val с делецией триплета TCG в первом экзоне гена Hprt1, приводящей к удалению валина из восьмого положения аминокислотной последовательности фермента HPRT. Мыши были полученные путём генетического редактирования системой CRISPR/Cas9 штамма CBAxC57Bl6J. В экспериментальную группу вошли самцы гемизиготы (Hemi, n=8), самки гетеро- и гомозиготы (Het и Homo, n=24); контрольная гру ппа состояла из самцов и самок дикого типа (WT) на генетическом фоне CBAxC57Bl6J, синхронизированные по возрасту (n=14). Животных содержали в кондиционированном помещении (приблизительно 20-24C) в 12-часовом цикле света/12-часового затемнения со свободным доступом к пище и водопроводной воде. Забор крови и анализ содержания мочевой кислоты проводились, начиная с 35-дневного возраста каждые 7-14 дней. Кровь объёмом 300 мкл забирали из лицевой вены, прокалывая стерильной иглой щеку животного и собирая в стерильную пробирку Эппендорфа с 0,1% ЭДТА. Во избежание ложного повышения уровня мочевой кислоты в плазме при инкубации в комнатных температурных условиях [7], пробирку с кровью сразу центрифугировали при 4000 g и 4оC в течение 10 минут. По окончании центрифугирования супернатант (плазму крови) отбирали дозатором со стерильным наконечником и переносили в новую пробирку. Образцы плазмы крови мышей хранились в кельвинаторе при -80оC до проведения их анализа. Оценку динамики содержания мочевой кислоты в плазме крови исследуемых мышей проводили с помощью спектрофотометрического анализа определения мочевой кислоты стандартным набором реагентов Мочевая кислота Парма (Парма Диагностика, Россия) с использованием аналитического оборудования Epoch 2 для микропланшетов BioTek при детекции в диапазоне длины волны 513 нм [8]. Статистический анализ данных выполнен с использованием пакета анализа GraphPad Prism 8. За критерий достоверности выбран критерий Стьюдента (при параметрическом распределении данных) или Т критерий Вилкоксона (при непераметрическом распределении данных при выполнении числа измерений больше 100) при р0,05. Результаты исследования. Согласно полученным данным в группе самцов достоверные различия в уровне мочевой кислоты выявлена на 5, 9 и 13 неделях постнатального развития на 21,1%, 21,79% и 28,84% соответственно (р0,05) по сравнению с контролем (рис. 1). Рис. 1 Динамика изменения концентрации мочевой кислоты у самцов группы Hemi в сравнении с контрольной группой мышей. В группе самок достоверные различия в уровне мочевой кислоты установлены на 5, 6, 10, 15 неделях у Homo на 59,78%, 60,45%, 10,33% и 37,33% соответственно (р0,05); у Het 45,01%, 61,68%, 22,05%, и 44,53% соответственно (р0,05) по сраневнию с контролем (рис. 2). Рис. 2 Динамика изменения концентрации мочевой кислоты у самок групп Homo и Het в сравнении с контрольной группой мышей. Заключение. Повышение уровня мочевой кислоты у мышей с делецией в первом экзоне гена Hprt1 свидетельствует о специфических метаболических изменениях, вызванных дисфункцией мутантного белка HPRT со сниженной аффинностью к субстрату. Сравнительный анализ динамики изменения концентрации аналита в плазме крови с возрастом доказывает необходимость такого подхода к изучению метаболических нарушений пуринового обмена у мышей с дисфункцией белка HPRT, так как анализ метаболита пуринового обмена в одной возрастной точке не способен дать полной картины метаболических изменений в плазме крови животных. Полученные данные свидетельствуют о пригодности разработанной персонализированной животной модели для изучения метаболических нарушений синдрома Леша-Нихана, что позволит разработать новые подходы к разработке персонализированной генетической терапии. Финансирование. Работа была финансирована из средств Государственного задания Лаборатории генетических технологий и генного редактирования для биомедициныиветеринарии FZWG-2021-0016.

Reduced levels of dopamine and altered metabolism in brains of HPRT knock-out rats: a new rodent model of Lesch-Nyhan Disease / S. Meek, A. J. Thomson, L. Sutherland [et al.] // Scientific Reports. – 2016. – Т. 6. – С. 25592.

New personalized genetic mouse model of Lesch-Nyhan syndrome for pharmacology and gene therapy / V. Kalmykov, P. Kusov, M. Yablonskaia [et al.] // Research Results in Pharmacology. – 2018. – Т. 4. – С. 97-104.

Description of the Molecular and Phenotypic Spectrum of Lesch-Nyhan Disease in Eight Chinese Patients / L. Li, X. Qiao, F. Liu [et al.] // Frontiers in Genetics. – 2022. – Т. 13. – С. 868942.

Harris J. C. Lesch-Nyhan syndrome and its variants: examining the behavioral and neurocognitive phenotype / J. C. Harris // Current Opinion in Psychiatry. – 2018. – Т. 31. – № 2. – С. 96-102.

HGprt deficiency disrupts dopaminergic circuit development in a genetic mouse model of Lesch–Nyhan disease / J. S. Witteveen, S. R. Loopstok, L. L. Ballesteros [et al.] // Cellular and Molecular Life Sciences. – 2022. – Т. 79. – № 6. – С. 341.

Torres R. J. Hypoxanthine-guanine phosophoribosyltransferase (HPRT) deficiency: Lesch-Nyhan syndrome / R. J. Torres, J. G. Puig // Orphanet Journal of Rare Diseases. – 2007. – Т. 2. – С. 48.

False In Vitro and In Vivo Elevations of Uric Acid Levels in Mouse Blood / T. Watanabe, N. H. Tomioka, S. Watanabe [et al.] // Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. – 2014. – Vol. 33. – № 4-6. – P. 192-198.

Uric Acid Levels in Tissues and Plasma of Mice during Aging / M. Iwama, Y. Kondo, K. Shimokado [et al.] // Biological and Pharmaceutical Bulletin. – 2012. – Vol. 35. – № 8. – P. 1367-1370.