Молодежный инновационный вестник

2415-7805

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный медицинский университет имени Н.Н. Бурденко" Министерства здравоохранения Российской Федерации

8099

Unclassified

THE EFFECT OF TEMPERATURE ON THE STRUCTURE OF A PROTEIN MOLECULE

Sekretareva

Ulyana S.

Studentsekretarevaulana3@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-6184-4552Kotova

Anastasia O.

Studentnastyusha.kotova13@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5032-1214

Voronezh State University

20042023

12S26062

29012023

24022023

2023

Relevance. The study of the influence of different temperatures on the structure of protein molecules is important for understanding the mechanism of changes in protein functions, determining the critical denaturation temperature, finds application in solving a number of practical problems, including in medicine. Thus, thermal denaturation can be used to remove proteins from various biological fluids, for example, blood plasma, which facilitates the processes of isolation and analysis of substances. Precipitation of proteins due to denaturation is used to determine their amount in the biomaterial [1]. Goal. The aim of our work was to study the effect of temperature on the protein structure, structural modifications of the protein globule were judged by the spectral properties and hydrodynamic radius of the native and thermomodified protein molecule. Materials and methods. Bovine serum albumin (BSA) was selected as a model protein, which was heated in a thermostat for 15 minutes to the appropriate temperature (37, 45, 55 and 60 C) Results. We studied the absorption spectra of solutions of native and thermomodified BSA, determined the contribution of light scattering to the absorption spectra of protein solutions. The hydrodynamic radius of the protein globule was studied by the method of dynamic light scattering. The change in the protein structure is reflected in the change in the absorption spectrum of this solution. During thermomodification of BSA solutions, the optical density of the studied solutions increases. We calculated the contribution of light scattering to the growth of optical density. It is shown that the parameters characterizing light scattering increase with an increase in the BSA heating temperature. Using the method of dynamic light scattering, it is shown that the radius of the native BSA globule is 3 nm, with an increase in temperature, the size of protein molecules increases. Conclusion. With the help of spectral methods, it is possible to determine the denaturation of protein molecules, as well as the reversibility of these processes.

bovine serum albuminlight scatteringhydrodynamic radiusabsorption spectrumtemperature

бычий сывороточный альбуминсветорассеяниегидродинамический радиусспектр поглощениятемпература

Актуальность. Изучение спектров поглощения биомолекул остается важным аспектом научных исследований. Влияние различных физико-химических факторов на организм приводит так или иначе к изменению структуры белков и других важных молекул, и благодаря этим знаниям можно фиксировать патологические состояния организма и находить их причины. Цель. Исследование влияния температуры на белки, т.е. на спектральные свойства и изменение их конформации, необходимо нам для понимания процесса повреждения биомолекул и определения обратимости/необратимости таких состояний. Материалы и методы. Растворы БСА (110-5 моль/л, 2 мл) нагревали в термостате в течение 15 минут до соответствующей температуры (37, 45, 55 и 60 С). Спектры поглощения (220 400 нм) растворов БСА регистрировали на спектрофотометре UV-2401 PC Shimadzu, спектральная ширина щели - 0.2 нм, шаг сканирования - 0.2 нм, сканирование проводили в режиме Slow. Измеряли спектры поглощения как нагретых до определенной температуры, так и остывших до 25 С растворов БСА Гидродинамический радиус определяли с помощью анализатора Zetasizer Nano (Malvern Instruments Ltd, Великобритания), коэффициент преломления 1.450, абсорбция 0.001. Размер сферических частиц рассчитывается по формуле Стокса-Эйнштейна, которая связывает размер частиц с их коэффициентом диффузии и вязкостью жидкости. Необходимые расчеты выполнены с помощью программных средств UVProbe (Shimadzu, Япония) и Microsoft Excel (Microsoft, США). Достоверность отличий сравниваемых показателей оценивали методом попарных сравнений с использованием программы STADIA (Россия) при уровне значимости р 0,05. Для проверки достоверности полученных данных использовали t-критерий Стьюдента. Все исследования были проведены на базе кафедры биофизики и биотехнологии ВГУ. Результаты. Нами были проведены исследования влияния температуры на спектральные характеристики раствора бычьего сывороточного альбумина. Было отмечено увеличение оптической плотности во всем исследуемом диапазоне длин волн, что говорит о структурных изменениях молекулы белка при нагревании. При этом повышение оптической плотности относительно нативного белка в максимуме поглощения при температуре 37 С составляет 6,8 %, при 45 и 55 С 9,1 %, при 60 С 13,6 %. Отличия были достоверны при всех температурах, кроме 37 С. Рис.1. Сравнение нативного и термомодифицированного раствора БСА При нагревании белковых растворов увеличивается тепловое движение отдельных атомов и полипептидных цепей в целом, в результате чего связи, поддерживающие пространственную структуру молекулы, разрушаются, ослабляются гидрофобные взаимодействия между боковыми радикалами. Таким образом, полипептидная цепь разворачивается, важную роль при этом играет вода: она способствует разворачиванию глобулы. В таком состоянии белок теряет свою активность, при этом возможно образование агрегатов из-за оказавшихся на поверхности гидрофобных радикалов аминокислот [2, 3]. Известно, что денатурационные изменения молекул БСА начинаются при температуре 45-48 С, плавление - при 60 С [4]. Необратимая денатурация бычьего сывороточного альбумина происходит при температурах свыше 50С и связана с разрушением -спиралей и появлением -структур. При наступлении стадии необратимой денатурации разворачивается карман, содержащий сульфгидрильную группу Cys-34, происходит формирование дисульфидных сшивок [5]. Измеренные значения оптической плотности представляют собой сумму истинной оптической плотности и вклада светорассеяния. Поправки на светорассеяние в области полосы поглощения вводятся путем экстраполяции из области, где истинное поглощение отсутствует, то есть в нашем случае, из области, лежащей в длинноволновую сторону от полосы поглощения - 320 400 нм. При изучении вклада светорассеяния было выявлено, что спектр термомодифицированного белка не отличается от рассчитанного нами истинного спектра поглощения. Рис.2. Спектр поглощения нативного БСА с учетом вклада светорассеяния. Нами также была изучена термостабильность (термолабильность) БСА. Известно, что она зависит от содержания жирных кислот, связанных с молекулой белка, обезжиренный альбумин подвергается двухфазной денатурации в водных растворах [5]. При охлаждении растворов БСА до комнатной температуры (через 15 минут после термической обработки) их оптическая плотность снижается, вид спектра приближается к нативному образцу. Отличия спектров во всем исследованном температурном диапазоне не являются достоверными по сравнению с нативным образцом. Это говорит о том, что денатурационные изменения были обратимыми, и происходит ренатурация БСА. Рис.3. Сравнение нативного раствора и раствора через 15 минут после термомодификации. Был измерен гидродинамический радиус нативной и термомодифицированной молекулы БСА методом динамического рассеяния света. Нативный белок имеет радиус 3,12 0,28 нм; раствор, нагретый до 37 С 3,45 0,23 нм; до 45 С 4,1 0,16 нм; до 55 С 5,34 0,28 нм; и до 60 С 3,63 0,46 нм. Отличия достоверны (по сравнению с нативным БСА) при 45 и 55 С. Также проведена оценка радиуса белка после остывания раствора, были получены следующие результаты. Охлажденный до комнатной температуры (25 С) белок, предварительно нагретый до 37С имеет радиус 3,63 0,46 нм; при 45 С 4,7 0,21 нм; при 55 С спустя 15 мин 4,95 0,17 нм; при 60 С 5,5 0,40 нм. Отличия оказались достоверными только при 45 С. По полученным данным можно судить об обратимости или необратимости денатурации. Сравнение гидродинамического радиуса нативного и термо-модифицированного бычьего сывороточного альбумина Таблица 1 <table> <tbody> <tr> <td width="311"> Образец </td> <td width="312"> Гидродинамический радиус, нм </td> </tr> <tr> <td width="311"> Нативный белок </td> <td width="312"> 3,12 0,28 </td> </tr> <tr> <td width="311"> Белок, нагретый при 37С </td> <td width="312"> 3,45 0,23 </td> </tr> <tr> <td width="311"> Белок, нагретый при 45С </td> <td width="312"> 4,1 0,16 </td> </tr> <tr> <td width="311"> Белок, нагретый при 55С </td> <td width="312"> 5,34 0,28 </td> </tr> <tr> <td width="311"> Белок, нагретый при 60С </td> <td width="312"> 4,5 0,30 </td> </tr> <tr> <td width="311"> Белок, нагретый при 37С спустя 15 мин </td> <td width="312"> 3,63 0,46 </td> </tr> <tr> <td width="311"> Белок, нагретый при 45С спустя 15 мин </td> <td width="312"> 4,7 0,21 </td> </tr> <tr> <td width="311"> Белок, нагретый при 55С спустя 15 мин </td> <td width="312"> 4,95 0,17 </td> </tr> <tr> <td width="311"> Белок, нагретый при 60С спустя 15 мин </td> <td width="312"> 5,5 0,40 </td> </tr> </tbody> </table> Обсуждение. Повышение оптической плотности в экспериментальных данных связано с происходящими денатурационными процессами в молекуле БСА. Полученные результаты согласуются с данными, полученными при расчете вклада светорассеяния. При увеличении температуры раствора увеличивается и гидродинамический радиус молекулы, и вклад светорассеяния. Заключение. Были получены результаты по определению вклада светорассеяния в спектр поглощения белка, подтверждающие возможность определения степени разворачивания белковой молекулы с помощью спектральных методов. Отмечена возможность применения данных методов с целью определения степени денатурации белка. Представленные методические подходы могут быть использованы для оценки структурных перестроек различных белков.

Артюхов, В. Г. ГЕМОПРОТЕИДЫ: закономерности фотохимических превращений в условиях различного микроокружения / В. Г. Артюхов. – Воронеж : Воронежский государственный университет, 1995. – 280 с. – ISBN 574550773X.

Лазерная корреляционная спектроскопия процессов денатурации сывороточного альбумина / А. Н. Баранов, И. М. Власова // Журнал прикладной спектроскопии. – 2004. – Т. 71. – № 6. – С. 831-835. – EDN HMRIXR.

Биофизика : Учебник для вузов./ В. Г. Артюхов, Т. А. Ковалева, М. А. Наквасина [и др.] ; АВТОРСКИЙ КОЛЛЕКТИВ: В.Г. Артюхов, Т.А. Ковалева, М.А. Наквасина, О.В. Башарина, О.В. Путинцева, В.П. Шмелев. – Москва; Екатеринбург : Издательство "Академический проект", 2009. – 295 с. – ISBN 9785829110819.

Власова Ирина Михайловна. Применение оптико-спектральных методов в исследованиях компонентов сыворотки крови : Дис. канд. физ.-мат. наук : 01.04.05 : Москва, 2005 – 184 c. РГБ ОД, 61:05-1/743

Борзова В.А. Механизмы защитного действия шаперонов при агрегации белков : Специальность 03.01.04 Биохимия : Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук / Борзова Вера Александровна. Москва, 2016 – 181 с.