Молодежный инновационный вестникМолодежный инновационный вестник2415-7805Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный медицинский университет имени Н.Н. Бурденко" Министерства здравоохранения Российской Федерации10242Conference ProceedingsSimulation of contraction and relaxation in a stopped rat heart using the Na-Ca metabolic systemDubokAleksandr Aleksandrovich<p>student</p>duboksash@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9133-4134ShibkovaPolina Romanovna<p>student</p>shibkovapol@yandex.ruhttps://orcid.org/0009-0008-5962-6901KurbanovIslam Bashirovich<p>student</p>kurb4nov.islam@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2357-7772AlabovskiyAleksey Vladimirovich<p>student</p>mr.alabovskiy@mail.ruhttps://orcid.org/0009-0005-6464-5902AlabovskiyVladimir Vladimirovich<p>Doctor of Medical Sciences, Professor of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics at N.N. Burdenko VSMU</p>v.alabovsky@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6306-5149KotovaYulia Aleksandrovna<p>Doctor of Medical Sciences, Professor of the Department of Clinical Diagnostics at N.N. Burdenko VSMU</p>kotova_u@inbox.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0236-2411BereshnovaTatyana Aleksandrovna<p>Doctor of Medical Sciences, Professor of the Department of Pharmacology at N.N. Burdenko VSMU</p>farmdecanat@vrngmu.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8401-3460VinokurovAleksey Anatolevich<p>Candidate of Medical Sciences, Assistant of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics at N.N. Burdenko VSMU</p>alwin66@rambler.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0677-4739KovalenkoIrina Viktorovna<p>Assistant Professor of the Department of Pharmacology at N.N. Burdenko VSMU</p>kovalenkoirin@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-3094-4307Voronezh State Medical University named after N.N.Burdenko2504202514S140461302202517022025Copyright © 2025, Dubok A.A., Shibkova P.R., Kurbanov I.B., Alabovskiy A.V., Alabovskiy V.V., Kotova Y.A., Bereshnova T.A., Vinokurov A.A., Kovalenko I.V.2025<p>Goal. The aim of the work is to develop a method for studying the kinetics of Na-Ca metabolism by continuously recording the contractile activity of an isolated rat heart, as well as studying the effect of certain cardioactive drugs on this process.</p>
<p>Materials and methods of research. The experiments were performed on isolated hearts of white rats perfused through the aorta using the Langendorff method.</p>
<p>The results of the study. Immediately after switching on the solution containing a high concentration of potassium (15 mmol/l), a complete cardiac arrest was observed. 5 minutes after cardiac arrest, cardiac perfusion was transferred to solution No. 3, which contained a reduced concentration of NaCI (30 mmol/l) and a high level of CI (15 mmol/l). An increase in heart tone was immediately observed. Registration of an increase and then decrease in tone in the stopped rat heart caused by a decrease and then restoration of the previous concentration of NaCI in the perfusion solution. However, immediately after reaching the max</p>cardiac arrestNa-Sa exchangeisolated rat heartmaximum contraction and relaxation forcesостановленное сердцеNа-Са обменизолированное сердце крысымаксимумы сил сокращения и расслабления<p><strong>Введение. </strong>Среди биохимических и биофизических сложных систем, первое место, занимает процесс сокращения и расслабления мышцы. В настоящее время этот механизм достаточно хорошо изучен. При работе над этой проблемой, часто возникает вопрос о выборе объекта исследования. Процесс сокращения и расслабления изучался на выделенных миофибриллах, изолированных кардиомиоцитах, мышечных полосках, на изолированных сердцах животных, непосредственно на мышцах в условиях in vivo у интактных животных.</p>
<p>Обладая теми или иными преимуществами, любой из перечисленных объектов исследования, достаточно труден в оценке особенностей молекулярных процессов, протекающих в момент сокращения и расслабления миофиламентов. Например, изучение кинетики ионных потоков в сарколемме и ретикулуме, участвующих в сокращениях мышцы.</p>
<p>Среди них, наибольшее внимание уделяют механизмам увеличения и удаления ионов кальция в мышцах во время систолы и диастолы. Известно, что инициирующим механизмом, заставляющим мышцу сокращаться, являются кальциевые каналы, которые открываются под влиянием различных стимулирующих сигналов. Сравнительно небольшое количество кальция, попав внутрь клетки, активируя рианодиновые рецепторы, вызывают высвобождение достаточного для сокращения кальция из ретикулума [1]. Расслабление мышцы связано с возвращением кальция из миофибрилл назад в ретикулум или во внеклеточную среду с затратой энергии.</p>
<p>Помимо транспорта кальция с помощью ионных каналов, предполагается еще один механизм, способный увеличивать или снижать внутриклеточную концентрацию этих ионов. Это система Nа-Са обмена [2].</p>
<p>Транспортный переносчик имеет активные центры снаружи и внутри клеток, с высоким сродством для ионов кальция и натрия. За овладение активным центром, между двумя катионами происходит конкуренция. В состоянии покоя, ни один из катионов не получает преимущественного перемещения через мембрану. Транспорт конкурирующего иона происходит только при повышении его концентрации снаружи или вне клетки.</p>
<p>Концентрация кальция внутри кардиомиоцита чутко реагирует на изменения уровня натрия: снижение внеклеточного натрия или его накопление внутри клетки стимулирует приток кальция, в то время как увеличение натриевого градиента способствует выведению кальция, преимущественно через Na+/Ca2+ обменник. Это делает ионы натрия важным фактором, контролирующим внутриклеточный кальций [3].</p>
<p>Поскольку при многих патологических заболеваниях сердца концентрация ионов натрия внутри клеток возрастает, уровень кальция в них тоже может увеличиваться. При нарастании этого нарушения возникает кальциевая перегрузка миокарда, которая нередко приводит к смертельным аритмиям сердца.</p>
<p>Вместе с тем, роль Nа-Са обмена при патологии до конца не изучена. Пока мало сведений о влиянии лекарственных средств на этот биохимический процесс. Данное обстоятельство объясняется тем, что до сих пор не созданы экспериментальные условия, позволяющие оценить состояние этого обменного процесса, в изолированном виде. Иными словами, весьма привлекательными являются такие модели, в которых можно изучать потоки ионов кальция, исключительно только с помощью Nа-Са обмена, без участия других механизмов транспорта кальция.</p>
<p>Важным условием изучения натрий зависимого перемещения ионов кальция через сарколемму мышц является устранение других потоков кальция. Ионы кальция могут проникать в клетки через медленные кальциевые каналы и выводиться Са-ионными насосами. В механизм регуляции внутриклеточного уровня Са могут принимать участие быстрые, натриевые каналы. Появление ионов натрия внутри клеток также может внести изменения в процесс Nа-Са обмена, что тоже является мешающим фактором в оценке работы одного только обменника натрия на кальций [4].</p>
<p>Поэтому, лучшим способом устранения этих помех, в изучении исключительно только Nа-Са обмена, является полное выключения натриевых и кальциевых каналов с помощью деполяризации мембран кардиомиоцитов.</p>
<p>Такой прием хорошо известен и осуществляется с помощью высокой внеклеточной концентрации ионов калия. При этом, наблюдается не только блокирование каналов, но и полная остановка сокращений сердца [5].</p>
<p>Вызывать сокращения и расслабления сердца, в этих условиях, можно только путем увеличения или снижения внутриклеточного уровня Са с помощью Nа-Са обменной системы.</p>
<p><strong>Цель работы. </strong>Целью настоящего исследования явилось изучение возможности инициации сокращения и расслабления в остановленном сердце, с помощью Nа-Са обменного механизма.</p>
<p><strong>Материалы и методы исследования. </strong>Эксперименты проводились на изолированных сердцах белых крыс, перфузируемых через аорту по методу Лангендорфа.</p>
<p>Для стабилизации сократительной функции сердца осуществляли перфузию исходным раствором №1 со скоростью 9-10 мл/мин на 1 г сырого веса в течение 10 минут.</p>
<p>Исходной перфузионной средой служил оксигенированный раствор Рингера-Локка (t = 37C), содержащий (в ммоль/л): NaCl 140, NaHCO3 2.0, KCl 5.0, Трис-ОН (pH = 7.4) 2.0, CaCl2 2.0, глюкозу 11.</p>
<p>Регистрацию сокращений и расслаблений сердца проводили с использованием резиновых баллончиков, соединенных с электронным датчиком давления. Сигналы от датчика поступали на аналогово-цифровой преобразователь. Параметры регистрировались и обрабатывались с использованием программного обеспечения внешнего модуля Zet Lab и компьютера.</p>
<p>Для прекращения сокращений сердца использовали раствор №2, идентичный исходному раствору, но с повышенной концентрацией KCl до 15 ммоль/л.</p>
<p>Инициацию натрий-зависимого поглощения кальция в изолированном сердце крысы осуществляли путем перфузии гипонатриевым раствором, в котором концентрация натрия была снижена с 140 до 30 ммоль/л. Концентрация KCl в гипонатриевом растворе (раствор №3) поддерживалась на высоком уровне 15 ммоль/л. Для компенсации недостатка осмотического давления в гипонатриевый раствор добавляли 220 ммоль/л маннитола. Концентрация маннитола была удвоена относительно недостающей концентрации NaCl, поскольку маннитол, в отличие от NaCl, не диссоциирует на отдельные частицы.</p>
<p>По окончании перфузии гипонатриевой средой осуществляли перфузию раствором, содержащим 140 ммоль/л NaCl и 15 ммоль/л KCl.</p>
<p>Статистическая обработка полученных результатов проводилась методом вариационной статистики. В работе обсуждаются результаты, для которых достигнут уровень значимости p 0.05.</p>
<p><strong>Результаты исследования. </strong>Сразу, после включения раствора, содержащего высокую концентрацию калия (15 ммоль/л), наблюдалась полная остановка сердечной деятельности, (рис 1).</p>
<p>Однако, сразу после достижения максимального пика сокращения происходило спонтанное (самопроизвольное) медленное ослабление тонуса, (рис. 2). После переключения раствора на прежний, содержащий исходную концентрацию NаСI (140 ммоль/л), наблюдалось снижние тонуса в изолированном сердце.</p>
<p>Поскольку поступление ионов Са в кардиомиоциты через электровозбудимые каналы было заблокировано, сокращение и расслабление мышцы были вызваны возрастанием, а затем снижением содержания ионов кальция в мышце сердца за счет иного механизма. В полученных нами опытах регулятором изменения ионов кальция, в данных опытах, исключительно являлся Nа-Са обмен.</p>
<p>Полученные графические изображения были обработаны математически, с целью использования данной методики для выполнения последующих этапов эксперимента.</p>
<p>Во-первых, показатель скорости нарастания сокращения (Vсокр) во время Nа-Са обмена демонстрирует противоположно протекающий обменный процесс, между ионами натрия, которые выводятся наружу и ионами кальция, которые в это время поступают в клетки. Данная реакция происходит, вследствие выигрыша конкуренции кальцием в активном центре обменника с наружной стороны миоцита. Кроме того, Vсокр. демонстрирует селективность обменника для кальция. В наших опытах он составил 28,2 мм рт. ст./c.</p>
<p>Скорость расслабления во время обращения Nа-Са обмена (Vрасслабл.). составила - 21,5 мм рт. ст./c.</p>
<p>Максимальная сила сокращения во время Nа-Са обмена (h 1) показывает максимальный результат Nа-Са обмена, при котором выход натрия, приводит к максимальному входу кальция в клетки и максимальному сокращению сердца. В наших опытах она составила 1339,3 мм рт. ст.</p>
<p>Отдельно была рассчитана разница между показателем максимумом сокращения и уровнем достижения процесса спонтанного снижения сокращения после пика сокращения (h 2). Это явление, пока нигде не описано в литературе. После достижения максимума сокращения, вызванным избытком кальция, наблюдается постепенное ослабление тонуса миокарда, несмотря на продолжение перфузии гипонатриевой средой.</p>
<p>Это свидетельствует о том, что в сердце происходит спонтанное, постепенное снижение концентрации кальция. Возможно, на этом этапе, включаются компенсаторные механизмы, ослабляющие контрактурные явления в миокарде. По-видимому, для устранения перенапряжения миофибрилл, активируются процессы удаления избытка кальция из саркоплазмы. Скорее всего, этими процессами являются Са-насосы саркоплазматического ретикулума, Са-насосы сарколеммы мышцы, а также митохондрии, которые обладают способностью аккумулировать избыток кальция в цитоплазме кардиомиоцитов. В наших расчетах процесс спонтанного снижения сокращения достигал 280 мм рт. ст.</p>
<p>Далее, были рассчитаны временные интервалы, в период которых происходило вначале сокращение, а затем, расслабление мышцы. Они составили: при сокращении 87 секунд, при расслаблении 166 секунд, (табл. 1).</p>
<p>Сокращение и расслабление мышечной ткани детерминируется быстрыми колебаниями внутриклеточной концентрации кальция. Регуляция уровня кальция в кардиомиоцитах осуществляется посредством комплекса механизмов, среди которых ключевую роль играют кальциевые каналы. Активация кальциевых каналов индуцирует высвобождение ионов кальция из саркоплазматического ретикулума, увеличивая его внутриклеточную концентрацию. Релаксация кардиомиоцитов наступает вследствие удаления ионов кальция из цитозоля с участием кальциевых АТФаз (Ca2+-АТФаз).</p>
<p>Участие другого механизма, Nа-Са обмена, в сокращении мышцы пока не доказано. Полагают, что этот процесс создает лишь постоянную концентрацию кальция в клетке и выполняет буферную роль. Вопрос об участии Nа-Са обмена непосредственно в цикле сокращение-расслабление, пока остается дискуссионным. Предполагается, что количества кальция, которое попадает в клетки за счет Nа-Са обмена недостаточно, чтобы осуществлять сократительную активность сердца [6].</p>
<p>Однако, существуют предпосылки о вовлечении Nа-Са обмена в сократительный процесс сердца. Во время возникновения потенциала действия, определенная порция ионов натрия появляется в примембранном пространстве внутри клеток. При этом, трансмембранная разность натрия падает до нуля и даже больше. Исходя из этого, можно предположить, что такого снижения уровня натрия может быть достаточно, для инициирования Nа-Са обмена, а следовательно, сокращения мышцы.</p>
<p>В связи с этим, в настоящей работе был изучен вклад Nа-Са обмена в процесс сокращения и расслабления сердца. Подобное исследование можно осуществить только в условиях блокирования потенциал-зависимых путей поступления кальция в клетки. Одним из способов их блокировки, является полная деполяризация мембран кардиомиоцитов. Предполагалось, что в данных условиях опытов, процесс сокращения и расслабления мышцы может стать зависимым, исключительно, только от величины трансмебранного градиента ионов натрия, то есть от интенсивности Nа-Са обмена.</p>
<p>Результаты проведенных нами исследований демонстрируют, что искусственное снижение трансмембранного градиента ионов натрия посредством уменьшения его внеклеточной концентрации индуцирует сокращение остановленного изолированного сердца крысы. Восстановление исходной внеклеточной концентрации натрия приводит к релаксации миокарда до исходного уровня. Данные изменения тонуса миокарда обусловлены исключительно механизмом Na+-Ca2+ обмена.</p>
<p>Расчеты показывают, что за 1 секунду скорость повышения напряжения мышцы при Nа-Са обмене составляет 25 мм рт. ст./с. Согласно результатам разных авторов, при открытии кальциевых каналов (в течении 0,13 секунды) скорость сокращения, в работающей мышце, достигает, около 1500 мм рт. ст./с, [7]. Это, примерно, в 60 раз быстрее, чем во-время Nа-Са обмена</p>
<p>Такие результаты следовало ожидать, поскольку причиной увеличения внутриклеточного уровня кальция в работающей мышце, при открытии кальциевых каналов, является электрическое возбуждение. В то же время Nа-Са обмен, представляет собой химическую реакцию, в которой участвуют не открытые ионные каналы, а ферментные системы.</p>
<p>Однако, процесс Nа-Са обмена, в отличие от потенциал-зависимых каналов, протекает до тех пор, пока остается сниженный трансмембранный градиент концентраций натрия. После деполяризации клеток следует процесс реполяризации, длительность которого больше длительности деполяризации, около 0,3 секунды.</p>
<p>За весь период деполяризации и реполяризации Nа,К-насос продолжает восстанавливать уровень калия и натрия, поскольку разность концентрации натрия продолжает оставаться низкой. Следовательно, процесс Nа-Са обмена функционирует все это время и поток кальция внутрь клеток продолжается после закрытия кальциевых каналов.</p>
<p>Учитывая скорость нарастания напряжения в мышце при инициировании Nа-Са обмена, а также период времени протекания этого процесса, можно рассчитать максимальное напряжение мышцы после завершения ионообменного процесса. По нашим расчетам он достигает 1339 мм рт. ст. за 87 секунд.</p>
<p>В результате, к потоку кальция, поступающего вначале, через открытые кальциевые каналы, может добавляться кальций, проникающий в клетки с помощью Nа-Са обмена. А к потоку кальция во время расслабления мышцы может прибавляться порция кальция во время его удаления Nа-Са обменной системой.</p>
<p>Таким образом, в работе выявлен процесс сокращения и расслабления сердца только за счет Nа-Са обмена. Этот механизм осуществлен в условиях выключения других путей поступления кальция внутрь клеток. Изученный метод, в отличие от других, позволяет целенаправленно наблюдать исключительно одну реакцию - натрий-зависимый путь повышения или снижения кальция в миокарде крыс.</p>
<p>Рассчитанные параметры химического процесса позволяют считать процесс Nа-Са обмена, непосредственным участником в сократительной активности сердца. Данный экспериментальный прием можно использовать для изучения работоспособности данного механизма при патологических состояниях сердца, а также исследовать особенности воздействия кардиотропных средств на миокард.</p>
<p><strong>Заключение. </strong>Процесс сокращения и расслабления в остановленном сердце крысы можно инициировать при помощи Nа-Са обменного механизма, в условиях блокирования сокращений путем полной блокировки натрий и кальциевых каналов.</p>
<p>По сравнению с известными данными о скорости роста напряжения мышцы в условиях потока кальция через медленные кальциевые каналы, скорость нарастания тонуса при Nа-Са обмене происходит медленнее.</p>
<p>Учитывая короткий период открытия медленных каналов по сравнению с длительным процессом Nа-Са обмена, сравнение максимумов сил сокращений, дает близкие расчетные показатели в обоих механизмах сократительной активности сердца.</p>
<p>Полученные результаты свидетельствуют, о возможности участия Nа-Са обменного механизма, в сокращении и расслаблении сердечной мышцы.</p>[Клиническая фармакология: учебник. В.Г. Кукес, Д.А. Сычев [и др.]; под ред. В.Г. Кукеса, Д.А. Сычева -6-е изд. , испр. и доп. -Москва: ГЭОТАР- Медиа, 2021.- 1924 с.: ил. ISBN 978-5-9704-588152][Donald W. Hilgemann Control of cardiac contraction by sodium: Promises, reckonings, and new beginnings.][Cell Calcium Volume 85, January 2020, 102-129][Carafoli, E; Santella, L; Branca, D; Brini, M. Generation, control, and processing of cellular calcium signals.][Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology (англ.)рус. : journal. 2001. — Vol.36, no.2. — P.102-160. doi:10.1080/20014091074183. — PMID 11370791][4. Ghassan Bkaily and Danielle Jacque Calcium Homeostasis, Transporters, and Blockers in Health and Diseases of the Cardiovascular System. International Journal of Molecular Sciences 2023, 24(10), 8803; https://doi.org/10.3390/ijms24108803][Ли ХИ, Ли Б.К., Чжон КУ, Ли С.М., Чон Ю Х., Ли Г.С., Хо Т., Мин Остановка сердца, вызванная калием, во время обычной сердечно-легочной реанимации на модели длительной остановки сердца с фибрилляцией желудочков у свиньи: технико-экономическое обоснование. Реанимация. 2013 Март; 84(3):378-383. PMID: 2294060][Michela Ottolia, Natalia Torres , John H.B. Bridge, Kenneth D. Philipson, Joshua I. Goldhaber. Na/Ca exchange and contraction of the heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 61 (2013) 28–33][Е. С. Прокудина , А. С. Горбунов, В. А. Казаков В.В. Саушкин , H.Н.Маслов][Морфофункциональные аспекты повреждения сердца иммобилизационном стрессе у крыс.][Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2019, T. 105,][№ 2, стр. 248-257]