Study of the toxicity of the drug Rinoferon in immature rats

Full Text

Введение. Острые респираторные инфекции занимают ведущее место в структуре инфекционной патологии у детей [1-3]. Высокая заболеваемость объясняется легкостью передачи инфекции, многообразием респираторных вирусов и их антигенной изменчивостью, наличием большого количества пневмотропных бактерий, а также возможностью длительной персистенции возбудителей на фоне возрастных особенностей иммунитета. Принимая во внимание, что система интерферона — важнейшее звено врожденного иммунитета, использование интерферона при лечении детей с острыми респираторными инфекциями является одним из наиболее перспективных направлений [4]. При этом в педиатрической практике особое место занимает генно-инженерный интерферон-α2b, безопасность и эффективность которого как при эндоназальном (в виде мази и геля) доказана в ряде исследований. В настоящее время является актуальным изучение токсичности нового генно-инженерного интерферона-α2b препарата Риноферон в виде спрея.

Целью работы является изучение токсических эффектов лекарственного препарата Риноферон, спрей назальный дозированный, 500 МЕ/доза (ОАО Фармстандарт-Лексредства, Россия) при многократном интраназальном введении в двух экспериментальных дозах самцам и самкам неполовозрелых крыс в течение 14 дней с последующим 14-дневным периодом отмены введения.

Материалы и методы исследования. Исследование проводилось на 36 самцах и 36 самках неполовозрелых (ювенильных) Беспородные белые лабораторные крысах массой 35-60 г в начале исследования. Для исследования были взяты животные, прошедшие карантинный режим в течение одной недели. Все животные содержались с соблюдением правил светового режима 12 часовой период освещения, температура 18-22◦С, влажность 50-65%, корм и вода-ad libitum, на стандартной диете лабораторных животных. Животные были получены из филиала «Столбовая» ГУ НЦБМТ РАМН (Московская обл.).  Все манипуляции с животными проводили с соблюдением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для эксперимента или в иных научных целях» [Derective2014/63/EU]. Все эксперименты были одобрены локальным Этическим комитетом (протокол № 7-2023 от 11 сентября 2023 г.). Объектами настоящего исследования являлись исследуемый препарат Риноферон, спрей назальный дозированный, 500 МЕ/доза (ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия). В качестве контроля использовали Носитель (Плацебо Риноферон). Для исследования 14-дневной токсичности при ежедневном интраназальном введении использовали две дозы препаратов: 1400 и 2800 МЕ/кг.

Животные случайным образом были распределены на три группы в соответствии с таблицей:

№ груп- пы	Тестируемый препарат	Количество животных				Доза Действую-щего вещества	Объем введения (мл/кг)
		Эвтаназия на 15-й день		Эвтаназия на 29-й день
		самцы	самки	самцы	самки
1	Плацебо	6	6	6	6	-	0,14 мл/кг*
2	Риноферон	6	6	6	6	1400 МЕ/кг	0,14 мл/кг
3		6	6	6	6	2800 МЕ/кг	0,14 мл/кг*

Примечание. * – дважды в течение дня с интервалом не менее 30 минут

 

Исследования проведены с использованием визуального, инструментального и лабораторного контроля за состоянием животных, современных методов оценки действия препаратов в соответствии с «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» под общей редакцией д.м.н. А.Н. Миронова и правилами надлежащей лабораторной практики GLP[5] .

При формировании групп проводили клинический осмотр. Детальный клинический осмотр проводили в первый день введения и еженедельно в последующем (приблизительно через 1 час после введения на 1-й, 7-й, 14-й, а также после отмены введения на 21-й, 28-й дни исследования в первой половине дня) по следующим признакам: поза\мышечный тонус; слюнотечение; реакция на взятие; пилоэрекция; экскреция-уринация/дефекация; вокализация; прикрытие глаз; дыхание; цвет кожи и слизистых; выделения вокруг глаз/носа; бдительность; подвижность.

Массу тела регистрировали при формировании групп непосредственно перед первым введением (1-й день), далее в период введения дважды в неделю (4-й, 7-й, 11-й, 14-й дни исследования), в период отмены введения также два раза в неделю (18-й, 21-й, 25-й, 28-й дни исследования). Масса тела голодного животного непосредственно перед некропсией на 15-й и 29-й дни исследования была взята для расчета процентного отношения массы органов к массе тела.

Потребление корма определяли количественно для клетки содержания еженедельно (6-7, 13-14, 20-21, 27-28 дни исследования) взвешиванием решетки с кормом в начале суток и спустя 24 часа.

Гематологический анализ проводили в день взятия проб крови по указанным ниже параметрам на гематологическом анализаторе CELL-DYN 3700 (Abbott Diagnostics): количество эритроцитов (RBC); уровень гемоглобина (Hb); гематокрит (HCT); количество лейкоцитов (WBC); количество лимфоцитов (LYM, LYM%); количество моноцитов (MON, MON%); количество гранулоцитов (GRA, GRA%); среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH); средняя концентрация гемоглобина в эритроците (MCHC); средний объем эритроцита (MCV); широта распределения эритроцитов по объему – коэффициент вариации (RDW); широта распределения эритроцитов по объему – станд. отклонение (RDW-SD); количество тромбоцитов (PLT); средний объем тромбоцитов (MРV); тромбокрит (PCT); широта распределения тромбоцитов по объему – коэффициент вариации (РDW).

В сыворотке крови определяли перечисленные ниже параметры с помощью автоматического биохимического анализатора AU640 (Olympus) с использованием соответствующих для каждого параметра наборов реагентов  (* – расчётные значения): аланинаминотрансфераза (ALT); аспартатаминотрансфераза (AST); щелочная фосфатаза (ALP); общий белок (TProt); альбумин (Alb); глобулин (G)*; альбумин/глобулин (A/G)*; глюкоза; креатинин (Crea); мoчевина (Urea); общий билирубин (TBil); холестерин (Chol); триглицериды (Trigs); Na+; K+; Cl-.

Были взвешены у всех животных при запланированной некропсии (парные органы были взвешены вместе; кроме абсолютного веса органов, определяли процентное отношение веса органа к весу тела): головной мозг, сердце, легкие, тимус, селезенка, печень, почки, надпочечники, яичники/семенники. Гистологические исследования проводили у животных из группы плацебо и групп, получавших максимальную дозу тестируемого препарата и препарата сравнения на 15-й и 29-й день исследования.

Статистический анализ выполнялся с помощью программного обеспечения Statistica 10, Microsoft Excel 2016. Различия определяли при 5%-ном уровне значимости.

Результаты исследования. Общее состояние животных не изменялось в течение всего срока наблюдения за ними. Смертности животных не было отмечено. Особенностей поведения у подопытных крысят, получавших интраназально исследуемый препарат Риноферон, отличных от животных, получавших плацебо, отмечено не было. [3, 4]. Интенсивность и характер двигательной активности не менялись в течение всех 28 дней наблюдения и не отличались от показателей контрольных животных. Судороги отсутствовали у всех животных, находившихся под наблюдением. Координация движений и тонус скелетных мышц у крысят в опытных группах не нарушались в течение 28 дней эксперимента и не отличались от соответствующих показателей контрольных животных. Реакция на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители была адекватной у всех подопытных животных, отличий между подопытными и контрольными животными не наблюдалось. Частота и глубина дыхательных движений у экспериментальных крысят визуально была неотличимой от животных из контрольной группы. Состояние волосяного и кожного покровов экспериментальных животных не отличалось от волосяного и кожного покровов контрольных животных. Нарушений функционирования органов чувств не было зарегистрировано ни у одного животного, находящегося под наблюдением в течение 28 дней. Во время 14-дневного введения исследуемых препаратов крысятам в изучаемых дозах, а также в течение последующих 14 дней после прекращения введения, видимые слизистые оболочки, как и у контрольных животных, оставались бледно-розового цвета, влажность их не изменялась, симптомы бронхита, конъюнктивита и ринита отсутствовали. Частота дефекации и мочеиспускания, консистенция фекальных масс и окраска мочи подопытных и контрольных животных не изменялись в результате интраназального введения изучаемого препарата в дозах 1400 и 2800 МЕ/кг.

Показатели массы тела крысят, наблюдавшиеся в течение 14 дней интраназального введения исследуемых препаратов в дозах 1400 и 2800 МЕ/кг, а также в течение 14 дней после отмены их введения, приведены в Таблице 2.

Этап   Группа		День эксперимента число наблюдений n
		1-й n=12	4-й n=12	7-й n=12	11-й n=12	14-й n=12	18-й n=6	21-й n=6	25-й n=6	28-й n=6
Плацебо самцы	M	40,33	47,52	54,13	60,28	67,41	72,30	79,63	87,37	94,48
	SD	4,18	5,38	6,37	7,68	8,25	6,47	7,67	8,34	9,50
Плацебо самки	M	43,60	50,82	57,96	64,71	72,61	78,43	85,58	93,85	102,77
	SD	4,22	4,82	5,45	5,82	6,51	9,85	8,97	11,61	15,07
Риноферон 1400 МЕ/кг самцы	M	41,07	48,15	55,54	63,25	71,88	81,92	88,73	98,45	105,38
	SD	5,22	6,60	7,16	7,54	9,25	9,39	11,69	13,99	14,47
	p	0,71	0,80	0,62	0,35	0,22	0,07	0,14	0,13	0,15
Риноферон 1400 МЕ/кг самки	M	43,07	50,59	57,72	65,68	74,34	85,03	93,93	101,53	109,82
	SD	4,84	6,04	7,31	8,94	10,14	9,17	11,02	12,76	16,33
	p	0,78	0,92	0,93	0,76	0,62	0,26	0,18	0,30	0,46
Риноферон 2800 МЕ/кг самцы	M	42,24	49,85	57,18	64,54	71,99	77,32	85,75	95,57	104,83
	SD	4,91	5,99	7,13	7,78	9,20	9,95	11,40	11,72	14,06
	p	0,32	0,33	0,28	0,19	0,21	0,32	0,30	0,19	0,17
Риноферон 2800 МЕ/кг самки	M	40,79	47,48	53,18	60,02	67,27	71,53	79,18	86,48	92,75
	SD	4,56	5,83	6,16	7,37	8,86	11,34	12,61	12,01	14,19
	p	0,13	0,14	0,06	0,10	0,11	0,29	0,33	0,31	0,26

Таблица 2 – Результаты влияния исследуемых препаратов на массу тела крысят (г)

К 14-му дню эксперимента в группах животных, получавших изучаемый препарат и препарат сравнения, статистически значимых отличий в показателях массы тела от группы контроля не наблюдалось. На протяжении всего периода наблюдения за животными была зарегистрирована положительная динамика набора массы тела, статистически значимого отставания в показателях массы тела крысят, получавших исследуемый препарат от группы контроля (плацебо) не наблюдалось.

Во всех группах наблюдалась схожая динамика потребления крысятами корма, при этом количество потребляемого животными корма соответствовало нормальным значениям показателей для животных данного вида и возраста. Значимых различий между опытными группами животных и группой контроля (плацебо) не наблюдалось.

Также отмечалось отсутствие изменения общего состояния, качественных и количественных показателей крови и функционального состояния внутренних органов экспериментальных крыс по сравнению с группой контрольных животных, получавших плацебо.

Результаты гематологических и биохимических исследований крови крысят на 15-е и 29-е сутки исследования у 12 животных из каждой группы (по 6 самцов и 6 самок) продемонстрировали отсутствие статистически значимых различий в исследуемых показателях между группами животных, получавших исследуемый препарат Риноферон в дозах 1400 и 2800 МЕ/кг, а также с контрольными животными из группы плацебо на обоих ключевых этапах исследования. Полученные данные свидетельствуют о том, что все тестируемые препараты в исследуемом диапазоне доз не оказывали негативного влияния на эритро-, лейко-, тромбопоэз, лейкоцитарную формулу и биохимические маркеры повреждения внутренних органов.

В ходе проведения некропсии визуально различимых изменений не было обнаружено ни у одного экспериментального животного. Патологических изменений волосяного покрова, кожи, легких, сердца, аорты, почек, надпочечников, матки, яичников, молочных желёз, семенников, простаты, щитовидной железы, паращитовидных желез, тимуса, лимфатических узлов, не выявлено. Брюшина влажная, гладкая, с естественным блеском, на ощупь скользкая. Спаечный процесс не обнаружен. Органы брюшной полости занимали типичное положение. Внутренние органы имели обычное расположение и макроскопическое строение. Видимых изменений видимые слизистые ротовой полости, стенки мочевого пузыря языка, не наблюдалось. Пищевод, желудок, тощая, ободочная кишка спавшаяся. Стенка ободочной кишки гладкая, эластическая, бледно-розового цвета, с естественным блеском, эластичная, с окружающими тканями не спаяна. Слизистая бледно-розового цвета с хорошо выраженными складками, изъязвления отсутствовали. Печень бледно-красно-коричневого цвета с естественным блеском, эластической консистенцией. Поверхность гладкая. Четко определялась долевая архитектура. Поджелудочная железа светло-розового цвета с естественным блеском, поверхность характерная для железистой структуры, эластической консистенции, гомогенная, без очаговых явлений, с окружающими тканями не спаяна. На разрезе ткань характерного вида для железистой ткани. Селезенка красного цвета, эластической консистенции. Поверхность мелко-бугристая, однородная. С окружающими тканями не спаяна. На разрезе паренхима однородная красного цвета, без очаговых изменений. Соскоб умеренный красного цвета.

При вскрытии грудной полости патологических изменений не обнаружено. Плевра не утолщена, прозрачна. На внутренней поверхности бледно-розового цвета, гладкая, имела естественный блеск. Спаечный процесс отсутствовал. Поверхность легких светло-розового цвета, с естественным блеском, гладкая. С окружающими тканями не спаяна. На разрезе ткань светло-розового цвета с визуализированными бронхами разного порядка. Очаговые явления отсутствовали. Соскоб розового цвета с пузырьками воздуха. Перикард полупрозрачный, бесцветный, не спаян с окружающими тканями. Внутренняя поверхность гладкая, с естественным блеском.

Головной мозг обычной формы. В обоих полушариях четко определяются извилины с кровеносными сосудами. Ткань головного мозга бледно-розового цвета, эластической консистенции. Очаговых явлений не обнаружено. Спинной мозг заполняет спинномозговой канал, имеет обычное строение, на разрезе имеет типичный вид «бабочки». Ликвор без патологических примесей. Периферические нервы без патологических изменений.

При применении плацебо масса органов составила: у самцов на 15-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,351 г (0,509%), легкие - 0,473 г (0,694%), тимус - 0,185 г (0,272%), печень - 2,556 г (3,761%), селезенка - 0,215 г (0,318%), почки - 0,680 г (1,000%), надпочечники - 0,020 г (0,030%), головной мозг - 1,277 г (1,878%), семенники - 0,958 г (1,410%); у самок на 15-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,368 г (0,511%), легкие - 0,514 г (0,694%), тимус - 0,198 г (0,268%), печень - 2,820 г (3,812%), селезенка - 0,233 г (0,314%), почки - 0,743 г (1,004%), надпочечники - 0,022 г (0,029%), головной мозг - 1,336 г (1,810%), яичники - 0,022 г (0,031%); у самцов на 29-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,0,444 г (0,471%), легкие - 0,566 г (0,599%), тимус - 0,215 г (0,227%), печень – 3,617 г (3,827%), селезенка - 0,293 г (0,309%), почки - 0,868 г (0,917%), надпочечники - 0,024 г (0,026%), головной мозг - 1,374 г (1,451%), семенники - 1,508 г (1,592%); у самок на 29-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,492 г (0,477%), легкие - 0,619 г (0,601%), тимус - 0,230 г (0,222%), печень – 3,919 г (3,801%), селезенка - 0,312 г (0,303%), почки – 0,943 г (0,915%), надпочечники - 0,027 г (0,026%), головной мозг - 1,493 г (1,450%), яичники - 0,040 г (0,039%).

В группе применения препарата Риноферон в дозе 1400 МЕ/кг достоверной разницы с группой плацебо не выявлено и составила у самцов на 15-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,345 г (0,503%), легкие - 0,480 г (0,687%), тимус - 0,191 г (0,274%), печень - 2,633 г (3,771%), селезенка - 0,221 г (0,316%), почки - 0,708 г (1,015%), надпочечники - 0,021 г (0,031%), головной мозг - 1,275 г (1,829%), семенники - 0,965 г (1,384%); у самок на 15-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,367 г (0,505%), легкие - 0,505 г (0,695%), тимус - 0,194 г (0,266%), печень - 2,790 г (3,835%), селезенка - 0,227 г (0,313%), почки - 0,731 г (1,006%), надпочечники - 0,021 г (0,029%), головной мозг - 1,336 г (1,835%), яичники - 0,022 г (0,031%); у самцов на 29-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,505 г (0,477%), легкие - 0,646 г (0,610%), тимус - 0,236 г (0,224%), печень - 4,045 г (3,825%), селезенка - 0,319 г (0,303%), почки - 0,963г (0,910%), надпочечники - 0,027 г (0,026%), головной мозг - 1,540 г (1,455%), семенники - 1,738г (1,646%); у самок на 29-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,516 г (0,469%), легкие - 0,657 г (0,598%), тимус - 0,248 г (0,226%), печень - 4,185 г (3,812%), селезенка - 0,333 г (0,304%), почки – 1,002 г (0,913%), надпочечники - 0,028 г (0,025%), головной мозг - 1,602 г (1,460%), яичники - 0,044 г (0,040%).

При применении препарата Риноферон в дозе 2800 МЕ/кг масса органов составила: сердце - 0,338 г (0,515%), легкие - 0,512 г (0,699%), тимус - 0,204 г (0,278%), печень - 2,782 г (3,797%), селезенка - 0,230 г (0,314%), почки - 0,735 г (1,004%), надпочечники - 0,023 г (0,031%), головной мозг - 1,375 г (1,878%), семенники - 0,978 г (1,334%); у самок на 15-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,347 г (0,506%), легкие - 0,480 г (0,701%), тимус - 0,179 г (0,260%), печень - 2,623 г (3,830%), селезенка - 0,217 г (0,317%), почки - 0,676 г (0,986%), надпочечники - 0,021 г (0,031%), головной мозг - 1,273 г (1,855%), яичники - 0,021 г (0,030%); у самцов на 29-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,487 г (0,468%), легкие - 0,619 г (0,595%), тимус - 0,232 г (0,224%), печень – 3,947 г (3,793%), селезенка - 0,308 г (0,296%), почки - 0,941 г (0,905%), надпочечники - 0,026 г (0,025%), головной мозг - 1,509 г (1,449%), семенники - 1,683 г (1,621%); у самок на 29-й день исследования масса органов составила: сердце - 0,441 г (0,476%), легкие - 0,568 г (0,614%), тимус - 0,207 г (0,224%), печень – 3,495 г (3,774%), селезенка - 0,282 г (0,304%), почки –
0,849 г (0,917%), надпочечники - 0,023 г (0,025%), головной мозг - 1,326 г (1,434%), яичники - 0,036 г (0,039%).

При макро- и микроскопическом исследовании внутренних органов и места введения препаратов не было обнаружено признаков токсических проявлений, вызванных введением исследуемых препаратов. Не наблюдалось патологических изменений у животных и в течение 14 дней после отмены введения препаратов. Дальнейшие гистологические исследования органов и тканей показали, что никаких видимых отличий в их строении у контрольных животных и крысят, получавших исследуемый препарат Риноферон в максимальной дозе 2800 МЕ/кг через 14 дней после начала введения и через 14 дней после отмены, не было.

Заключение.

На основании проведенного исследования сделано заключение, что в протестированном диапазоне доз от 1400 до 2800 МЕ/кг исследуемый препарат Риноферон, спрей назальный дозированный, 500 МЕ/доза (ОАО Фармстандарт-Лексредства, Россия) по критериям токсичности в условиях многократного интраназального введения не было обнаружено признаков токсических проявлений, вызванных введением исследуемых препаратов у неполовозрелых самцов и самок крыс.

About the authors

Anikanova Viktorovna Tatiana

Belgorod State National Research University Research Institute of Pharmacology of Living Systems

Email: malorodova_tn@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8122-3382

PhD student of the Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology, Belgorod State National Research University

Russian Federation, 308015, Belgorod, Victory Street, 85

Tatyana Grigorievna Pokrovskaya

Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education "Belgorod State National Research University"
Research Institute of Pharmacology of Living Systems

Author for correspondence.
Email: pokrovskaia@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6802-5368
SPIN-code: 8338-0100

Doctor of Medical Sciences, Professor of the Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology

Russian Federation, 308015, Russia, Belgorod, st. Pobeda, 85,

References