Changes in neurons of the cingulate cortex of the 2nd small cell layer of the rat brain in cholestasis

Full Text

 

Введение. Когнитивные нарушения являются одним из осложнений заболеваний печени у людей и животных. У детей и взрослых с дисфункцией печени, наблюдались нарушения коэффициента интеллекта, обучения и памяти, а также зрительно-пространственных функций. Известно, что крысы с холестазом хуже справляются с прохождением водного лабиринта Морриса, у них отмечается пассивность и нарушение памяти узнавания [1].

Известно, что в выполнении когнитивных функций принимает участие поясная кора, которая является частью лимбической системы и относится к аллокортексу («атипичная кора»). Влияние холестаза на неокортекс («типичная кора») изучено. Тем не менее информация о влиянии прогрессирования холестаза на поясную кору головного мозга в литературе отсутствует.

Цель работы. Изучить изменения нейронов поясной коры 2-го мелкоклеточного слоя мозга крысы при подпеченочном холестазе.

Материалы и методы. Эксперимент проводился на 72 беспородных белых крысах самцах массой 225±25 грамм. Контрольных и опытных животных содержали в стандартных условиях вивария, в индивидуальных клетках со свободным доступом к воде и полноценной пище. Исследование проведено в соответствии с принципами биоэтики и требованиями Директивы Европейского Парламента и Совета № 2010/63/EU от 22.09.2010 о защите животных, использующихся для научных целей [2]. Подпеченочный холестаз моделировали по методу Л. С. Кизюкевича путем перерезки общего желчного протока (ОЖП) между двумя лигатурами на 2–3 мм ниже места слияния печеночных протоков [3]. Выбор уровня перевязки/перерезки, обусловлен тем, что перевязка выше этого уровня может не приводить к полному холестазу, а ниже него в ОЖП впадают многочисленные протоки поджелудочной железы, перевязка которых приводит к развитию панкреатита и быстрой гибели всех животных [4]. Животным контрольной группы проводили ложную операцию с сохранением физиологического тока желчи в двенадцатиперстную кишку на протяжении всего эксперимента. Животных контрольной и опытной группы, после усыпления в парах эфира, декапитировали на 2-е, 5-е, 10-е, 20-е, 45-е и 90-е сутки. Для исследования брали кусочки больших полушарий головного мозга, фиксировали их в жидкости Корнуа при +4 ºС (на ночь), а затем заключали в парафин. Фронтальные срезы толщиной 7 мкм готовили с помощью микротома (LeicaRM 2125 RTS, Германия) и монтировали на предметные стекла. Препараты окрашивали по методу Ниссля (0,1 % водным раствором тионина) для анализа их цитоплазмы по степени хроматофилии. Для выявления содержания рибонуклеопротеинов (РНП) препараты окрашивали галлоцианин-хромовыми квасцами по методу Эйнарсона. Для идентификации поясной коры использовали схемы стереотаксического атласа. Морфометрию нейронов проводили в мелкоклеточном слое поясной коры.

Для анализа цитоплазмы нейронов поясной коры по степени хроматофилии подсчитывали процент нормохромных (умеренная интенсивность окраски цитоплазмы), гиперхромных (интенсивная окраска цитоплазмы), гиперхромных сморщенных (интенсивная окраска цитоплазмы и деформированный перикарион), гипохромных (со слабой окраской цитоплазмы) нейронов и клеток-теней (очень слабое окрашивание).

Цитофотометрическое исследование гистохимических препаратов проводили, определяя оптическую плотность полученного осадка хромогена в цитоплазме нейронов поясной коры, на максимуме поглощения окрашенных продуктов реакций. Относительное содержание вещества выражали в единицах оптической плотности.

Изучение гистологических препаратов, их микрофотографирование и морфометрию проводили при разных увеличениях микроскопа Axioskop 2 plus (Zeiss, Германия), встроенной цифровой видеокамеры Leica DFC 320 (Leica Microsystems GmbH, Германия) и программы компьютерного анализа изображения Image Warp (BitFlow, США).

Данные полученные при морфометрическом исследовании обрабатывали с помощью лицензионной компьютерной программы Statistica 10.0 для Windows (StatSoft, Inc., США, серийный номер AXAR207F394425FA-Q). В работе использовали описательную статистику, анализ данных проводили методами непараметрической статистики. Для каждого показателя определяли значение медианы (Me), значение нижнего квартиля (LQ), значение верхнего квартиля (UQ) и интерквартильного диапазона (IQR). Объекты исследования набирали в группы независимо друг от друга, поэтому сравнение групп по одному признаку проводили с помощью критерия Манна-Уитни для независимых выборок (Mann-Whitney U-test). Различия между группами считали статистически значимыми, если вероятность ошибочной оценки не превышала 5 % (p<0,05; где р – критическое значение уровня значимости).

Результаты исследования. При анализе размеров и формы нейронов 2-го мелкоклеточного слоя установлено, что через 2 суток после перерезки ОЖП значительные изменения не выявляются.

На 5 сутки после перерезки ОЖП происходит уменьшение площади перикарионов нейронов мелкоклеточного слоя на 6,2% (р <0,001), их большого радиуса – на 5,6 % (р <0,001), периметра – на 4,3% (р <0,001), форм-фактор – на 4,5% (р <0,01). При этом увеличивается фактор их элонгации – на 9,6% (р <0,001). На 10-е сутки в сохранившихся нейронах уменьшена площадь перикарионов - на 5,3 % (р <0,05), большой радиус – на 4,8 % (р < 0,001), периметр – на 3,3 % (р <0,05), а фактор элонгацииувеличен– на 7,2% (р <0,001). На 20-е сутки уменьшен малый радиус – на 2,6 % (р<0,05), форм-фактор – на 2,3 % (р<0,01), а фактор элонгации увеличен на – 6,4 % (р <0,01).

На 45 и 90 сутки после перевязки ОЖП внейронах мелкоклеточного слоя поясной коры достоверных изменений морфометрических параметров не наблюдается. 

При анализе размеров и формы ядер нейронов мелкоклеточного слоя поясной коры установлено, что у крыс опытной группы на 2, 5 - сутки после перерезки ОЖП не выявляется значительных изменений.

На 10 сутки после перерезки ОЖП происходит уменьшение площади ядер сохранившихся нейронов на 13,9 % (р <0,01), большого радиуса – на 5,6 % (р< 0,001),малого радиуса – на 7,1% (р<0,001), периметра – на 10,3% (р <0,001). На 20-е сутки достоверно меньше площадь ядер – на 11,9 % (р<0,001), периметр – на 1,6% (р < 0,05), при малый диаметр выше – на 1,5% (р < 0,05),  форм-фактор – на 3,6% (р< 0,05). При этом у опытных животных происходит увеличение ядерно-цитоплазматического отношения (ЯЦО) на 5 сутки после перерезки ОЖП на 14,9%, на 10 сутки на 10,1%, на 45 сутки на 4,1%.

На 45 и 90 сутки после перевязки ОЖП не наблюдается достоверных изменений изученных морфометрических параметров ядер.

Таким образам наибольшие изменения в нейронах мелкоклеточного слоя поясной коры после перерезки ОЖП наблюдаются через 10 и 20 суток. Полученные данные согласуются с показателями биохимического анализа крови исследуемых животных, согласно которому пик холестаза приходится на это же время. При этом, происходит значительное уменьшение количества нейронов, что свидетельствует о их гибели. В сохранившихся нейронах уменьшаются размеры перикарионов и ядер, увеличивается ЯЦО. При этом изменяется и форма перикарионов нейронов, они становятся более вытянутыми и менее сферичными. В отдаленные сроки 45-е и 90-е сутки после перерезки ОЖП все исследуемые показатели приходят к контрольным значениям, что возможно связано с образованием обходных желчных выводных протоков и устранением холестаза [5].

При количественной оценке числа нейронов с разной хроматофилией цитоплазмы установлено, что в мелкоклеточном слое поясной коры на 2-е сутки количество нормохромных нейронов достоверно уменьшается на 4,8 %, на 5-е 14,0%. При этом возрастает количество гиперхромных нейронов на 33,3%, гиперхромных сморщенных на 53,8% и гипохромных на 39,1%, клеток-теней на 90% (p< 0,05, при сравнении с опытной группой) (таблица 1).

 В мелкоклеточном слое поясной коры холестаз в течение 10 суток приводит к уменьшению числа нормохромных нейронов на 10-е сутки на 17,5% при этом увеличивается количество гиперхромных на 26,5%, гиперхромных сморщенных на 44,4%, клеток-теней на 90% (p< 0,05, при сравнении с опытной группой).

На 20-е сутки холестаза происходит значительное уменьшение нормохромных нейронов мелкоклеточного слоя на 16,6 %, при этом возрастает количество гиперхромных на 66,7%, гипохромных на 38,1%, а клеток теней на 69,2% (p<0,05, при сравнении с опытной группой) (таблица 1).

Таблица 1. Число нейронов с разной хроматофилией цитоплазмы 2-го мелкоклеточного слоя поясной коры мозга крыс после перевязки общего желчного протока, окраска по методу Ниссля, в %

Сутки		Показатель
		нормохромные	гиперхромные	гиперхромные сморщенные	гипохромные	клетки-тени
2-е	К	77,5	7,5	6,5	6,5	2
	О	73,75*	8,75	6,75	7,75	3
5-е	К	77	8,25	6,5	5,75	2,5
	О	66,25	11*	10*	8*	4,75
10-е	К	77	8,5	6,75	5	2,75
	О	63,5*	14,75	9,75	6,5	5,5*
20-е	К	75,25	9	7,25	5,25	3,25
	О	62,75*	15*	9,5	7,25*	5,5*
45-е	К	73	9,25	8	5,75	4
	О	66,75*	11,5	10,25	7	4,5
90-е	К	74	9,5	7,5	6	3
	О	71,75	9,5	8,5	6,75	3,5

Примечание: * – р < 0,05, при сравнении показателей контрольную группу сравнивали с опытной

На 45-е сутки холестаза происходит уменьшение нормохромных нейронов мелкоклеточного слоя на 8,6%, количество гиперхромных сморщенных растет на 28,1% (p< 0,05, при сравнении с опытной группой) (таблица 1).

Через 90 суток после перевязки ОЖП гистологические изменения в нейронах поясной коры постепенно нормализуются, что хорошо заметно и при подсчете числа нейронов с различной хроматофилией цитоплазмы.

Заключение. После перерезки ОЖП по мере развития холестаза в поясной коре происходит постепенное уменьшение размеров нейронов и их ядер, которое достигает максимума на 5, 10, 20-е сутки в мелкоклеточном слое. По мере уменьшения площади перикарионов нейронов и их ядер в мелкоклеточном слое, их форма вытягивается (возрастает фактор элонгации). По мере нарастания холестаза происходит увеличение числа патологических форм нейронов 2-го мелкоклеточного слоя поясной коры. В дальнейшем, через 45-90 суток после перерезки ОЖП, происходит постепенная нормализация размеров и формы изучаемых нейронов.

About the authors

Tatsiana Viktorovna Klimuts

Grodno State Medical University

Email: klimuts@yandex.ru

postgraduate student of the Department of Histology, Cytology and Embryology

Belarus, 230009, Belarus, Grodno, st. Gorky, 80

Anastasiya Victorovna Zaerko

Grodno State Medical University

Email: wersall_91@mail.ru

Candidate of Biological Sciences, Senior Lecturer at the Department of Histology, Cytology and Embryology

Belarus, 230009, Belarus, Grodno, st. Gorky, 80

Sergei Vladimirovich Emelyanchik

Grodno State University named after Yanka Kupala

Author for correspondence.
Email: kaf_gigpit@grsu.by
ORCID iD: 0000-0000-0000-0001

Dr.Sci.Biol.

Belarus, 3/1 Dovatora lane, k.118, 230012 Grodno

References

Supplementary files

There are no supplementary files to display.