RAZRABOTKA ALGORITMA OTsENKI KAChESTVA VNEKLETOChNYKh MATRIKSOV
- Authors: Gulova NV1, Volkov AV1, Sundeev AS1, Neverov AV1, Gladysheva EV1, Maleev Y.V1, Shevtsov AN1
-
Affiliations:
- Issue: Vol 7, No S1 (2018)
- Pages: 17-18
- Section: Articles
- URL: https://new.vestnik-surgery.com/index.php/2415-7805/article/view/3882
Cite item
Full Text
Abstract
Full Text
Актуальность. Наиболее актуальной проблемой трансплантологии на современном этапе, как известно, является значительная нехватка донорских органов. Методы тканевой инженерии, такие, как выращивание донорских органов на внеклеточных матриксах (ВКМ) представляются наиболее актуальным направлением решения этих проблем [1, 2, 3]. Однако, современные способы получения ВКМ, к сожалению, проработаны не до конца. Децеллюляризирующий агент оказывает пагубное влияние на структуру, биологические свойства адгезивные возможности матрикса [4, 5]. В связи с этим, развитие указанного направления возможно путем оптимизации протоколов децеллюляризации целых органов. Такие способы получения ВКМ не должны влиять на молекулярный состав и архитектуру ВКМ. Цель работы. Разработка и апробация алгоритма оценки уровня децеллюляризации экспериментально получаемых ВКМ. Материалы и методы. Для выполнения работы были исследованы 4 группы крыс линии Long-Evans, массой около 300 г. (три экспериментальных - по 10 животных в каждой и одна контрольная - 4 животных). В v.cava inferior и v.portae были введены канюли. Инфузия 0,2 ЕД гепарина позволила предупредить свертывание крови в печени крыс. Для дальнейшей перфузии была разработана система, состоящая из роторного насоса и замкнутой системы трубок. Перфузия выполнялась по полуоткрытому контуру. Децеллюляризирующая жидкость проникала в печень через v.portae, далее проходила по сосудам органа и свободно изливалась через остальные сосуды. Децеллюляризирующий раствор готовился путем разведения додецилсульфата натрия в фосфатном буфере до однопроцентной концентрации с добавлением 0,02% ЭДТА. Перфузия выполнялась в течение суток, рабочий раствор трижды за цикл заменялся свежим. Контрольная группа включала две печени, перфузированные по описанному протоколу, а также две интактные печени. Первая экспериментальная группа включает десять органокомплексов, которые после обработки фосфатным буфером (30 мин.) замораживались на сутки при -20°С. Вторая экспериментальная группа также включала десять органокомплексов, которые перед замораживанием были обработаны 10%-ным раствором проникающего криопротектора глицина (30 мин.). В третьей экспериментальной группе десять органокомплексов перед замораживанием обрабатывались 5%-ным раствором непроникающего криопротектора трегалозы (30 мин.). Органокомплексы каждой из экспериментальных групп спустя сутки размораживались и подвергались перфузионной децеллюляризации по приведенному выше протоколу. Результаты децеллюляризации оценивались в несколько этапов по описанному нами алгоритму. При субъективной оценке обращалось внимание на окраску органа, уровень визуализации сосудов, прозрачность ткани, целостность объемной структуры препарата. Объективная оценка производилась путем микроскопирования предварительно окрашенных препаратов (окраска гематоксилином-эозином и по Ван-Гизон). Обращалось внимание на присутствие мертвых клеток в препарате, сохранность структуры ВКМ, присутствие повреждений сети, отека тканей. Данный этап позволял оценить уровень децеллюляризации и сохранность гликопротеидов ВКМ. Наконец, с целью определения уровня презервации гликопротеидов ВКМ (эластин, ламинин, фибронектин) проводился иммуногистохимический анализ препаратов. Результаты. Контрольная группа. При гистологическом анализе органокомплексов обнаружен межклеточный отек, единичные участки ткани (в области ворот печени), с хорошим качеством децеллюляризации, множественные участки ткани с клеточным детритом и отдельные локусы с интактными гепатоцитами. При ИГХ интактных печеней выявлена удовлетворительная экспрессия гликопротеидов матрикса, сохранность сети, отсутствие повреждений ВКМ. Первая экспериментальная группа. Визуально объемная структура препарата изменена, определяются разрывы, идущие через капсулу в паренхиму органа. В области ворот ткань печени прозрачна, в ней визуализируются сосуды. Важно отметить, что ткань препарата, расположенная дистальнее разрывов, теряет прозрачность и меняет цвет на светло-коричневый, сосуды не определяются. Все это позволяет утверждать, что децеллюляризация выполнена не достаточно качественно. На гистологии на фоне внеклеточного отека выявляется тканевой детрит и островки интактных гепатоцитов. При ИГХ срезов ворот печени, гликопротеиды ВКМ не повреждены, структура матрикса изменена, выявляются единичные разрывы, обусловленные тканевым отеком и отсутствием презервации матрикса перед замораживанием. Вторая экспериментальная группа. Визуально ткань органокомплексов непрозрачная, целостная, повреждений нет, цвет препарата светло-коричневый, сосуды не определяются. Подобная картина, очевидно, соответствует плохому качеству децеллюляризации. Гистологически среди неизмененных гепатоцитов выявлены локусы тканевого детрита, ВКМ имеет нормальную структуру, определяется выраженный межклеточный отек. Иммуногистохимическое исследование показало низкую экспрессию гликопротеидов ВКМ. Вероятно, при перфузии ВКМ был поврежден децеллюляризирующим агентом. Третья экспериментальная группа. Визуально ткань макропрепарата однородна и прозрачна, сквозь толщу органа хорошо определялись сосуды, объемная структура органокомплекса не нарушена Гистологически ВКМ имеет нормальную структуру, межклеточный отек отсутствует. Не обнаружено ни интактных гепатоцитов, ни тканевого детрита. На основании данных признаков можно говорить о высоком качестве децеллюляризации. Уровень сохранности элементов внеклеточного матрикса при ИГХ оценен как удовлетворительный. Количество фибронектина и эндостатина соответствовало аналогичному в контрольных образцах. Эластин же сохранился в меньших количествах, однако повреждения трехмерной структуры его сети не выявлено. Выводы. Предложена и экспериментально апробирована методика оценки уровня децеллюляризации ВКМ каркасов. С помощью предложенного алгоритма выполнена оценка уровня децеллюляризации ВКМ крысиной печени, полученных с использованием различных протоколов.About the authors
N V Gulova
A V Volkov
A S Sundeev
A V Neverov
E V Gladysheva
Yu V Maleev
A N Shevtsov
References
- Langer R. Perspectives and challenges in tissue engineering and regenerative medicine. Adv Mater. 21; 2009: 3235-6.
- Badylak S.F., Freytes D.O., Gilbert T.W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. ActaBiomater.2009; 5: 1-13.
- Ott H.C. [et al.] Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 2008; 14: 213-21.
- Черных А.В. Применение внеклеточных криопротекторов для получения органных матриксов / А.В. Черных, Ю.В. Малеев, А.Н. Шевцов, А.Ю. Пульвер, Б.Е. Лейбович // Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. - 2016. - Т. 19., №1 (56). С 68-73.
- Черных А.В. К вопросу о получении внеклеточных матричных каркасов методом перфузионной децеллюляризации / А.В. Черных, Ю.В. Малеев, А.Н. Шевцов, А.Ю. Пульвер, Б.Е. Лейбович // Вестник новых медицинских технологий. - 2016. - Т. 10., №3. С 149-156.