RAZRABOTKA SPEKTROFOTOMETRIChESKOGO METODA OPREDELENIYa SODERZhANIYa ATsETILKhOLINA V BIOLOGIChESKOM MATERIALE

Abstract

Full Text

Актуальность. В настоящее время приобретает всё большую актуальность проблема определения микроколичеств биологически активных веществ в биоматериале. Для целей медицинских цитологических, диагностических и токсикологических исследований становятся важны экспрессность и чувствительность методик определения биогенных аминов, позволяющих своевременно диагностировать и корректировать патологические состояния [1]. В развитии патогенных состояний, связанных с нарушением нервно-мышечной передачи, таких как деменция, паркинсонизм, болезнь Пика и др., основную роль играет недостаток, избыток или изменение нормальной активности системы ацетилхолин -ацетилхолинэстераза [2]. Однако нестабильность данного нейромедиатора в водной среде, связанный с быстрым гидролизом и образованием свободного холина и остатка уксусной кислоты, затрудняет точное определение активного ацетилхолина в пробах биологического материала [5]. Ввиду вышеперечисленного, целью исследования является разработка и усовершенствование методики определения ацетилхолина в пробах биологического материала, отличающейся высокой точностью, чувствительностью, экспрессностью и воспроизводимостью. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи: - спектрофотометрическое исследование растворов субстанции ацетилхолина в различных растворителях; - выбор оптимального растворителя - экстрагента; - спектрофотометрическое исследование очищенных экстрактов из биологического материала c использованием стандарта для расчёта содержания ацетилхолина; - спектрофотометрическое исследование очищенных извлечений из биологического материала, обработанных адсорбционным индикатором эозинатом натрия, с использованием стандарта для расчёта содержания ацетилхолина; - определение содержания ацетилхолина в пробах биологического материала с использованием методики биологической индикации на спинальной мышце пиявки (по методике В. Фельдберга); - сравнительный метрологический анализ и корреляция полученных данных. Материалы и методы. В качестве объектов исследования использовались пробы биологического материала лабораторных крыс весом 550 649 г, введённых в состояние наркоза хлороформом. Для определения содержания ацетилхолина были выбраны изолированный участок блуждающего нерва (n.vagus) и участок коленной фасции. Для получения извлечения хирургически отделялся участок блуждающего нерва крысы длинной 1 см. После тщательного промывания нерв подвергался электростимуляции пьезоэлементом, отделялся и помещался в пробирку Эппендорфа на 2 мл, заполненную ледяной уксусной кислотой. После отстаивания нерв удаляли из пробирки, извлечение фильтровали. Аналогично получали извлечение из участка коленной фасции. Для проведения испытания методом биологической индикации водное извлечение из биологической пробы наносилось на изолированную спинную мышцу пиявки медицинской, обработанную раствором неостегминаметилсульфата, в количестве 0,1 мл, затем измерялась величина сокращения по изменению длины участка мышцы с точностью до 0,5 мм [4]. Расчёт концентрации ацетилхолина в водном извлечении проводился с использованием стандартного водного раствора субстанции ацетилхолина с концентрацией 0,01 г/мл. Для предотвращения гидролиза и инактивацииацетилхолинэстеразы проба биологического материала первоначально подвергалась экстракции ледяной уксусной кислотой, затем производилась смена растворителя методом упаривания на водяной бане и последующей реэкстракции водой очищенной. При проведении эксперимента хирургически изолированную спинальную мышцу пиявки в фиксированном состоянии измеряли штангенциркулем, затем на поверхность наносился точный объём измеряемого раствора, отмечалось сокращение мышцы, и замер повторялся. По вычисленному изменению длинны мышцы рассчитывалось содержание ацетилхолина в измеряемом растворе. Спектрофотометрическое исследование проводилось на спектрофотометре UV-1800 SHIMADZU, в качестве жидкости сравнения применялась ледяная уксусная кислота. На первом этапе спектрофотометрического исследования полученные спектры извлечений подвергались сравнительному анализу относительно спектра стандартного раствора субстанции ацетилхолина в ледяной уксусной кислоте с концентрацией 0,01 г/мл, отмечалось совпадение формы пиков на спектрах. Затем по значениям интенсивности поглощения света при длине волны λmax= 232нм при анализе стандартного раствора ацетилхолина проводили вычисление содержания ацетилхолина в полученном извлечении по формуле: Сизвл. = А × 0,01 / Аст., где Сизвл. - концентрация ацетилхолина в извлечении, г/мл; А - измеренное значение интенсивности поглощения света в извлечении при λmax= 232нм; 0,01 - концентрация стандартного раствора ацетилхолина, г/мл; Аст. - значение интенсивности поглощения света раствором ацетилхолина 0,01 г/мл при λmax= 232нм. На втором этапе спектрофотометрического исследования выполнялся анализ извлечений в присутствии индикатора эозината натрия. Раствором сравнения служил 0,125‰ раствор эозината натрия в ледяной уксусной кислоте. Отмечали совпадение формы спектра стандартного раствора ацетилхолина и спектра извлечения, максимум интенсивности поглощения света наблюдался при λmax= 474-476 нм. Расчёт концентрации ацетилхолина проводили аналогично вышепредставленному методу. По каждой методике были проведены исследования в объёме не менее пяти проб. Кратность измерений показателей каждой пробы равна трём. Выводы. В процессе исследований было выявлено, что методика спектрофотометрического анализа в присутствии эозината натрия обладает наилучшей воспроизводимостью и наибольшей чувствительностью, предел обнаружения ацетилхолина составляет 0,02 мг/ мл. Предел обнаружения ацетилхолина по методике спектрофотометрического анализа извлечений биоматериала ледяной уксусной кислотой составляет 0,2 мг/ мл, однако в процессе исследований было обнаружено, что анализ сопровождается большой вероятностью наличия случайных ошибок. Метод биологической индикации имеет предел обнаружения ацетилхолина равный 0,2 мг/мл, но является субъективным, большое значение при получении результатов и выполнении анализа играют навыки наблюдателя, и большое количество случайных факторов ставит под сомнение истинность полученных результатов. Однако данная методика не требует специальной очистки биоматериала и подходит для определения ацетилхолина не только в специально очищенных и полученных извлечениях, но также в крови и других биологических жидкостях сложного многокомпонентного состава, в то время как методики, основанные на применении метода спектрофотомерии, требуют специальной обработки биоматериала, так же на результаты анализа может повлиять содержание неингаляционных наркозных средств, способных исказить форму получаемых спектров, что требует проведения дополнительных перерасчётов при вычислении содержания ацетилхолина [3]. Сферы возможного применения методики, основанной на спектрофотометрическом методе анализа: - лабораторные исследования по изучению фармакологической активности лекарственных препаратов, влияющих на холинэргическую активность; - токсикологические исследования при определении причин отравления холинэргическими препаратами; - цитологические и физиологические фундаментальные исследования.