K VOPROSU O POLUChENII ORGANNYKh MATRIKSOV
- Authors: Putilin SG1, Raskina EA1, Shevtsova VI1, Chernykh AV1, Maleev Y.V1, Shevtsov AN1
-
Affiliations:
- Issue: Vol 5, No 1 (2016)
- Pages: 55-58
- Section: Articles
- URL: https://new.vestnik-surgery.com/index.php/2415-7805/article/view/2972
Cite item
Full Text
Abstract
Full Text
Актуальность. Одним из перспективных направлений решения проблем трансплантологии является выращивание иммуносовместимых донорских органов посредством культивирования собственных стволовых клеток реципиента на каркасе внеклеточного матрикса (ВКМ) донорских органов [1, 2]. ВКМ в тканевой инженерии являются не только формообразующим фактором, но и контролируют функции клеток, а также стимулируют образование новых тканей [3]. Трехмерные каркасы должны быть биосовместимыми, биодеградируемыми, а также регулировать клеточную пролиферацию, морфогенез и дифференцировку [4, 5, 6]. Главным недостатком существующих методов получения ВКМ является неблагоприятные воздействия на состав, биологическую активность и биомеханические свойства ВКМ. В последнее время разрабатываются методики получения ВКМ путем децелюлляризации целых органов [7, 8, 9]. Дальнейшие перспективы развития данного направления нам видятся в разработке методик децеллюляризации целых органов, оказывающих минимальное воздействие на химический состав и объемную структуру ВКМ, а также минимизации побочных эффектов, вызванных замораживанием органокомплексов. Цель работы. Улучшение результатов перфузионной децеллюляризации внутренних органов с презервацией элементов внеклеточного матрикса путем предварительно выполняемого цикла замораживания-оттаивания с использованием внеклеточных криопротекторов. Задачи. 1. Разработать и применить на практике алгоритм оценки результатов децеллюляризации, позволяющий достоверно оценивать качество получаемых в лабораторных условиях ВКМ каркасов. 2. Доказать эффективность предложенной методики по сравнению с известными аналогами. Материалы и ход эксперимента. Эксперимент выполнен на 34 самцах крыс линии Long-Evans, средней массой 300±50 г. Все животные были разделены на 3 группы (по 10 в каждой). Четыре крысы оставлены в группе контроля. Под общей анестезией в стерильных условиях выполнялось канюлирование нижней полой и воротной вен. Для предотвращения свертывания крови в сосудистую систему печени под постоянным давлением со скоростью 2 мл/мин нагнетался раствор гепарина (0,2 ЕД). Это значительно облегчало ход последующей децеллюляризации, обеспечивая ее равномерность. Печень отделялась от фиксирующего ее связочного аппарата и вместе с иссеченным сухожильным центром диафрагмы выделялась из раны. Перфузия печени выполнялась с помощью специально разработанной системы, включающей роторный насос, обеспечивающий циркуляцию по замкнутой системе трубок. Печень помещается непосредственно в емкость с децеллюляризирующим раствором, который по заборной трубке с помощью роликового насоса через воздушную ловушку поступает в канюлю, введенную в v. portae. Проходя сквозь сосудистое русло печени, перфузат естественным путем изливается обратно в емкость через просветы v. cava inferior, a. hepatica communis и (диффузно) через интактную печеночную капсулу. Стандартная схема перфузионной децеллюляризации включала в себя 24 часовую перфузию 1%-ым раствором лаурилсульфата натрия (SDS, додецилсульфат натрия), приготовленным на основе фосфатного буфера с добавлением 0,02% ЭДТА, с периодической подменой раствора спустя 1, 8 и 16 часов. После окончания перфузии для очищения сосудистого русла органа от децеллюляризирующих агентов, литических ферментов и тканевого детрита, органокомплекс в течение 15 минут подвергался перфузии физиологическим раствором. В качестве контроля выполнена децеллюляризация двух органокомплексов по предложенной схеме без предварительного цикла замораживания-оттаивания органокомплекса, а также проведено иммуногистохимическое (ИГХ) исследование двух свежеизъятых печеней, не подвергавшихся обработке. В первой серии экспериментов органокомплексы после изъятия из раны подвергались тридцатиминутной перфузии фосфатным буфером для поддержания нормального кислотно-щелочного баланса. Затем органокомплексы замораживались при -20°С. Спустя 24 часа после замораживания, органокомплекс подвергался размораживанию при 37ºС на водяной бане. Во второй серии экспериментов перед замораживанием органокомплексы перфузировались в течение 30 минут 10%-ным раствором глицерина (проникающего криопротектора) в фосфатном буфере. Третья серия экспериментов отличалась тем, что перед заморозкой органокомплексы перфузировались в течение 30 минут 5%-ным раствором трегалозы (непроникающего криопротектора) в фосфатном буфере. Во всех сериях экспериментов после размораживания выполнялась децеллюляризация по вышеописанной схеме. Субъективно результаты перфузии оценивались по специально разработанному протоколу, включающему следующие параметры: окраска органа, прозрачность ткани, степень видимости сосудистого русла, сохранность объемной структуры органа. Для объективной оценки полученных результатов выполнялось гистологическое исследование препаратов, предварительно окрашенных гематоксилином, эозином и по Ван-Гизон. Это позволяло оценить степень децеллюляризации и сохранность структуры элементов внеклеточного матрикса. При этом учитывалось наличие клеток в срезе, сохранность структуры сети матрикса, наличие его разрывов, внутритканевого отека. Для определения степени презервации функционально важных гликопротеидов внеклеточного матрикса (фибронектин, эластин, ламинин) на заключительном этапе работы выполнено ИГХ исследование. При выполнении исследований и оформлении результатов работы были учтены «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные Приказом Минвуза №742 от 13.11.1984 г. Результаты. При выполнении гистологического исследования препаратов контрольной группы, установлено, что на фоне межклеточного отека отмечаются локусы удовлетворительно децеллюляризированной ткани, расположенной преимущественно у ворот печени, а также участки с клеточным детритом и отдельные островки с сохранившимися гепатоцитами. Для контроля иммуногистохимического исследования взяты две свежеизъятые печени. Отмечена хорошая экспрессия элементов матрикса, целостность сети, отсутствие разрывов. В первой серии экспериментов перед децеллюляризацией органокомплексы подвергались циклу замораживания-оттаивания без предварительной перфузии криопротекторами. При визуальном осмотре объем печени снижен, объемная структура нарушена, на поверхности долей при микроскопии выявлены повреждения (разрывы капсулы и паренхимы). Ткань печени в области ворот прозрачная, белая, в толще видны сосуды, однако дистальнее разрывов ткань печени светло-коричневая, непрозрачная, сосуды не видны, что свидетельствует о низком качестве децеллюляризации. Это подтверждено и результатами гистологического исследования. При микроскопии выявлен внеклеточный отек, наличие большого количества клеточного детрита и островки с гепатоцитами. При выполнении иммуногистохимического исследования срезов на уровне ворот печени, элементы внеклеточного матрикса сохранены, однако его структура нарушена: матрикс значительно разрежен, отмечаются разрывы, нарушена объемная структура; что объясняется наличием внеклеточного тканевого отека и отсутствием презервации матрикса перед замораживанием. Во второй серии экспериментов органокомплекс перед замораживанием перфузировался 10%-ым раствором глицерина. При визуальном осмотре ткань без разрывов, светло-коричневая, не прозрачная, сосуды не контурируются, что свидетельствует о низкой степени децеллюляризации. При микроскопии срезов, сделанных на уровнях светло-коричневой и неизмененной ткани, на фоне интактных гепатоцитов присутствуют участки клеточного детрита, структура внеклеточного матрикса сохранена, выражен межклеточный отек. При ИГХ исследовании выявлена сниженная экспрессия гликопротеидов. По-видимому, при децеллюляризации ВКМ был значительно поврежден. В третьей серии экспериментов перед выполнением перфузии по стандартной схеме печень подвергалась циклу замораживания-оттаивания с предварительной перфузией 5% раствором трегалозы. Визуально ткань печени белая, прозрачная, однородная. В толще ткани контурируются сосуды. Объемная структура органа сохранена При микроскопии срезов, сделанных на нескольких уровнях, получены следующие результаты. Структура внеклеточного матрикса сохранена, отмечаются единичные микроразрывы структуры матрикса. Отек не выражен. Обращает на себя внимание полное отсутствие гепатоцитов и тканевого детрита, что позволяет оценить степень децеллюляризации как хорошую. Степень презервации гликопротеинов, образующих ВКМ, оценивали при помощи ИГХ. При визуальном сравнении с контрольным образцом установлено, что фибронектин и эндостатин сохранились в достаточной мере. Эластин при ИГХ исследовании обнаружен в гораздо меньших количествах, чем в контрольном образце, однако нарушения трехмерной структуры образуемой им сети не обнаружено. Обсуждение. На наш взгляд, факт наличия большого количества клеточного детрита и островков с гепатоцитами в образцах первой серии обусловлен тем, что децеллюляризирующий раствор не попадает на периферию долей печени из-за нарушения целостности сосудов в области повреждений ткани печени. Низкая степень децеллюляризации во второй серии эксперимента предположительно объясняется защитным действием глицерина на клетки образца на стадии замораживания; для компенсации этого может потребоваться пролонгирование перфузии децеллюляризирующим агентом. С целью подтверждения гипотезы, вне рамок эксперимента, перфузия была продолжена до 36 часов от начала опыта. Полученные результаты, в целом, повторяют результаты третьей серии эксперимента, что свидетельствует о положительном влиянии на результаты децеллюляризации предварительной перфузии органокомплекса любыми криопротекторами. Тем не менее, основываясь на результатах эксперимента, можно утверждать, что преддецеллюляризационная перфузия раствором непроникающего криопротектора (трегалозы) увеличивает скорость децеллюляризации примерно в полтора раза по сравнению с методикой, в которой используется проникающий криопротектор (глицерин). Это объясняется различиями в механизмах действия внеклеточных (непроникающих) и внутриклеточных (проникающих) криопротекторов. Внутриклеточные криопротекторы, проникая сквозь клеточную мембрану, образуют водородные связи с молекулами воды, препятствуя как вне-, так и внутриклеточному формированию кристаллов льда. Внеклеточные криопротекторы же действуют только в межклеточном пространстве, не предохраняя клетки от образования внутриклеточного льда, что обеспечивает более быструю децеллюляризацию. Выводы. Разработан и применен на практике алгоритм оценки результатов децеллюляризации, позволяющий достоверно оценивать качество получаемых в лабораторных условиях ВКМ каркасов. Установлено, что предварительная заморозка органокомплекса, перфузированного раствором криопротектора, положительно влияет на результаты децеллюляризации. При этом преддецеллюляризационная перфузия внеклеточными криопротекторами сокращает время последующей перфузии примерно в 1,5 раза. Предложен способ перфузионной децеллюляризации печени крысы, основанный на использовании в качестве действующего агента 1% раствора додецилсульфата натрия с предварительной заморозкой органа, перфузированного 5% раствором трегалозы. Предложенная методика по ряду оцениваемых параметров является более эффективной, чем известные аналоги, позволяя в короткие сроки получать качественные внеклеточные матричные каркасы с максимальной презервацией матричных гликопротеидов.×
References
- Griffith L.G., Naughton G. Tissue engineering - current challenges and expanding opportunities. Science. 2002; 295: 1009-14.
- Langer R. Perspectives and challenges in tissue engineering and regenerative medicine. Adv Mater. 21; 2009: 3235-6.
- Badylak S.F., Freytes D.O., Gilbert T.W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. ActaBiomater. 2009; 5: 1-13.
- Adachi E., Hopkinson I., Hayashi T. Basement-membrane stromal relationships: interactions between collagen fibrils and the lamina densa. Intern. Rev. Cytol. 1977; 173: 73-156.
- Giancotti F.G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. CurrOpin Cell Biol. 1997; 9: 691-700.
- Giancotti F.G., Ruoslahti E. Integrin signaling. Science. 1999; 285: 1028-32.
- Ott H.C. [et al.] Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 2008; 14: 213-21.
- Ott H.C. [et al.] Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 2008; 16: 927-33.
- Petersen T.H. [et al.] Tissue-engineered lungs for in vivo implantation / T.H. Petersen [et al.]. Science. 329: 538-41