PERSPEKTIVY RAZVITIYa REGENERATORNOY MEDITsINY
- Authors: Volkov AV1, Sundeev AS1, Shevtsova VI1, Chernykh AV1, Maleev Y.V1, Shevtsov AN1
-
Affiliations:
- Issue: Vol 5, No 1 (2016)
- Pages: 25-28
- Section: Articles
- URL: https://new.vestnik-surgery.com/index.php/2415-7805/article/view/2954
Cite item
Full Text
Abstract
Full Text
По данным Всемирной Организации Здравоохранения в текущем столетии ожидается увеличение заболеваемости и инвалидизации среди людей трудоспособного возраста. Несмотря на постоянный прогресс медицины всё так же остро стоит проблема трансплантации органов. В настоящее время, основные проблемы трансплантологии связаны с острой нехваткой донорских органов, сложностью их доставки, трудностью поиска иммунологически совместимых органов и пожизненным назначением иммуносупрессивной терапии, высокой долей вероятности развития неблагоприятных осложнений (3). Это вызывает потребность в новых, не требующих иммунносупрессивной терапии методах лечения для восстановления или замещения поврежденных тканей и органов, что позволит избежать сложностей, связанных с аллогенной трансплантацией. Тканевая инженерия включает в себя разработку и модификацию биологических (природных) или искусственных биоабсорбируемых каркасов (носителей), а также оценку и поддержание жизнеспособности клеток или тканей, взаимодействующих с ними (1). Натуральный внеклеточный матрикс, являясь комплексом структурных и функциональных белков, может быть рассмотрен, как основа для развития тканевой инженерии (4).Подробное рассмотрение данной проблемы S.F. Badylak (2007) показало, что внеклеточные матриксы обладают всеми характеристиками, необходимыми для создания тканеинженерного каркаса (2). В сложившейся ситуации в качестве многообещающего терапевтического подхода при лечении заболеваний и травм заявляет о себе тканевая инженерия, соединяющая воедино клетки, биологически совместимый материал клеточных каркасов биологически активные молекулы. Наиболее предпочтительным является использование тканеспецифичных каркасов для создания тканеинженерных конструкций. Попытки создать биоинженерные органы сопряжены с рядом трудностей: рациональный подбор внедряемых клеток, эффективное засевание клеток, васкуляризация инженерных тканей, обеспечение аутентичных сигналов для развития тканей. Для создания подходящего каркаса биоинженерного органа необходимо следующее. Во-первых, воссоздание структуры, сходной с нативной. Во-вторых, сосудистая сеть должна обеспечивать адекватную перфузию тканей. В-третьих, необходимо, чтобы клетки, используемые при рецеллюляризации, были способны к дифференцировке во все паренхиматозные и сосудистые структуры органа. В-четвертых, наличие возможности управления микроокружением клеток для воздействия на их физиологию и функции. В-пятых, должна существовать возможность управления дифференцировкой и созреванием клеток invitro. При этом каркасы биоинжененого органа должны повторять механические и биологические свойства матрикса нативного органа, т.е. есть иметь трехмерную структуру, способствующую прикреплению, росту и размножению соответствующего типа клеток, обеспечивая тем самым доступ к клеткам ростовых факторов и механическую прочность и стабильность органа. Оптимальный биоинженерный орган должен иметь анатомическую и морфологическую структуру и посылать химические и биологические сигналы, аналогичные нативной ткани. Первым успехом в этой области стало создание бесклеточных матриксов из эмбриональных фибробластов мыши, на которых удалось поддерживать рост человеческих эмбриональных стволовых (ЭС) клеток, сохраняя их пролиферативный потенциал и способность к дифференцировке. Тем же способом на бесклеточных матриксах можно выращивать мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК). При культивировании ММСК invitro в обычных культуральных флаконах их способность к дифференцировке снижается в зависимости от продолжительности культивирования. Для преодоления этой проблемы используются матриксы, получаемые из ММСК. На этих бесклеточных матриксах ММСК могут культивироваться без подавления способности к спонтанной дифференцировке. Как уже указывалось выше, состав клеточного окружения является одним из наиболее мощных индукторов дифференцировки клеток (чем хороши в этом отношении ВКМ-матриксы, получаемые из тканей и органов, так это тем, что засеваемые в них клетки не только сами «знают», куда им прикрепляться и мигрировать, но и сами дифференцируются в то, что требуется и там, где надо). Значительное продвижение в направлении создания биокаркасов было связано с использованием децеллюляризации тканей для получения трехмерных матриксов. Децеллюляризация - это способ получения биологических каркасов, который направлен на удаление клеток с сохранением внеклеточного матрикса (ВКМ) и трехмерной структуры органа. Практической целью децеллюляризации является максимально полное удаление клеток из тканей с минимальными повреждениями ВКМ. Методы децеллюляризации позволяют получать биологические (природные) каркасы с сохранением внеклеточного матрикса и трехмерной структуры органов; их необходимо децеллюляризировать, чтобы сделать неиммунногенными. Неспособность природных материалов полностью воспроизводить сложную структуру межклеточного матрикса привела к необходимости использовать децеллюляризированные естественные межклеточные матриксы, полученные от доноров, либо матриксы, полученные из полимерных материалов и полностью воспроизводящие структуру нативного органа. Полученные таким образом матриксы способны стимулировать клеточную пролиферацию, хемотаксис, а также ответное ремоделирование тканей пациента. Однако, несмотря на то, что межклеточные матриксы, полученные от доноров, стимулируют репарацию тканей, успешность их применения находится в зависимости от способа их получения (выбранного метода и протокола децеллюляризации). Для проведения децеллюляризации могут использоваться различные способы: физические, ферментативные и химическиe. Под физическими подразумеваются: механическое воздействие, циклы замораживания-оттаивания, обработка ультразвуком. При ферментативном используются трипсин, эндонуклеазы, экзонуклеазы. В настоящее время для проведения децеллюляризации используются различные химические агенты. Детергенты подразделяются на классы: кислоты и щелочи, ферменты, гипертонические и гипотонические растворы, ионные и неионные детергенты, хелатирующие агенты и бимодальные детергенты. Выбор действующего агента и метода децеллюляризации определяется морфологической структурой и свойствами исследуемого органа. Однако, необходимо учитывать, что любой химический агент повреждает матрикс в той или иной степени, и речь идет только о минимизации последствий. После проведения децеллюляризации, важно оценить полноту её проведения. В ходе морфологического исследования образцов децеллюляризированных органов отмечается, что ткани после удаления клеток теряют характерный им цвет и приобретают характерную молочно-белую окраску, присущую всем децеллюляризированным тканям. Поскольку при методах децеллюляризации невозможно удалить 100% клеток, существуют различные методы количественной оценки оставшихся компонентов клеток - таких, как ДНК, митохондрии или мембран-ассоциированные молекулы, например, фосфолипиды. С помощью децеллюляризации эффективно удаляются клеточные компоненты, но одновременно оказывается ряд неблагоприятных воздействий на состав, биологическую активность и биомеханические свойства остающегося в результате внеклеточного матрикса. В настоящее время в тканевой инженерии применяются бесклеточные ВКМ каркасы из большого числа различных тканей: сердца, сердечных клапанов, кровеносных сосудов, подслизистой оболочки тонкого кишечника, легких, трахеи, кожи, нервов, роговицы, пищевода, печени, почек, мочевого пузыря, хрящевой ткани, связок, жировой ткани, амниотической оболочки. ВКМ потенциально являются, во-первых, как это ни парадоксально, лучшим субстратом для стволовых клеток, чем здоровые ткани, а во-вторых, с помощью ВКМ имеется потенциальная возможность задавать направление их дифференцировки. ВКМ представляет собой сложный комплекс, состоящий из множества разнообразных полисахаридов, протеинов, гликопротеидов и протеогликанов. Межклеточное вещество рыхлой волокнистой соединительной ткани состоит из волокон и аморфного вещества. Оно является продуктом деятельности клеток этой ткани, в первую очередь фибробластов. Архитектоника и состав ВКМ в каждой ткани являются уникальными, определяют ее функциональность. Молекулярный состав и трехмерная структура ВКМ постоянно динамично меняются и перестраиваются, а свойства ВКМ (состав, микроструктура и эластичность) различаются в зависимости от типа ткани и определяют тканеспецифичные функции клеток. Каркасы ВКМ: способствуют формированию участка соответствующей ткани в месте имплантации; контролируют функции клеток, а также стимулируют образование новых тканей; способны модулировать сигнальную трансдукцию. Подразумевается, что органный ВКМ будет задавать постадийную дифференцировку стволовых клеток, имитирующую процессы, протекающие в эмбриогенезе, что позволит «восстанавливать» органы относительно полноценно без применения множества различных типов дифференцированных клеток. Присутствие в ВКМ клеточных компонентов, цитоплазмы и ядра, может способствовать нарушению клеточной биосовместимости invitro и вызывать побочные реакции в условиях invivo при последующей рецеллюляризации. Помимо трудности имитации состава ВКМ, столь же трудно воссоздать его сложную микроструктуру и архитектуру молекулярных сетей. Главный недостаток у ВКМ один: потенциальная иммуногенность. С одной стороны, компоненты ВКМ эволюционно высококонсервативны и малоизменчивы - они не дают отторжения даже у реципиентов иных видов (это одно из главных преимуществ бесклеточных ВКМ). Однако на практике существует реальная проблема возникновения воспалительных и иммунологических реакций. Наиболее изученными являются ВКМ тонкого кишечника, мочевого пузыря, кожи, весьма популярны бесклеточные матриксы из амниотической оболочки благодаря ее легкой доступности. Амнион имеет ВКМ как со стороны базальной мембраны, так и со стороны стромы. Человеческий амнион давно широко используется при многих хирургических вмешательствах, таких как пересадка кожи, реконструктивные операции на влагалище и в хирургии глаза. Как оказалось, амниотический ВКМ обладает противовоспалительным и антимикробным эффектами. Для ряда тканей и органов требуются именно тканево-специфичные ВКМ-каркасы. При отказе клеток мигрировать, происходит потеря их специфических функций, что является одной из главных проблем тканевой инженерии. С помощью методик децеллюляризации проводятся реконструкции «жизнеспособных» створок клапана легочного ствола. Шесть таких клапанов были имплантированы овцам на 3 месяца и затем отмечалось практически полное гистологическое восстановление ткани и полное покрытие поверхности эндотелием во всех случаях. Получившиеся «клапаны» оказались морфологически схожими с естественными аналогами. Основная польза этого направления в том, что компоненты ВКМ возможно в растворимом виде инъецировать пациенту, а те, в свою очередь, самоорганизуются в искусственную межклеточную среду прямо в месте введения. Теоретически они могут заполнить любое трехмерное пространство, и могут быть доставлены в место введения с помощью малоинвазивных хирургических манипуляций. Типичными примерами подобных гелеобразных ВКМ являются инъекционный гель на основе матрикса свиного мочевого пузыря(в эксперименте способствовал адгезии гладкомышечных аортальных клеток крысы) и на основе матриксов ткани миокарда(в эксперименте после инъекции матрикса invivo значительно усиливалось образование артериол за счет миграции эндотелиальных и гладкомышечных клеток). В перспективе рассматривается возможность долгого хранения ВКМ. В аспекте сохранения тканей распространенным вариантом стала криопротекция - криоконсервация бесклеточных матриксов с использованием криопротекторов и ее высушивание с последующим восстановлением, что позволяет уменьшить разрушения от кристаллизации льда. Хранение бесклеточных ВКМ, полученных из целых органов (далее «органных ВКМ»), в лиофилизированном виде - дешево, удобно, к органным ВКМ . После получения ВКМ производится рецеллюляризация - заселение каркаса ММСК для восстановления структуры органа. Введение клеток, таких как местные сидящие и циркулирующие стволовые и прогениторные клетки может играть ключевую роль в регенерации. Стволовые клетки (СК) представляют большой интерес для тканевой инженерии благодаря их способности к самообновлению и дифференцировке. Источником ММСК чаще всего служит красный костный мозг. Теоретически, при использовании эмбриональных стволовых или индуцированных полипотентных клеток в идеале возможно получение «восстановленного» органа или ткани, не отличающихся от натуральных. Обычно используются методы засевания клеток в матрикс путем статичного, динамичного или биореакторного засевания; в результате чего клетки могут проникать лишь на несколько мм от поверхности, в дальнейшем приживаясь и активно мигрируя. В клинической трансплантологии матриксы обычно заселяются клетками в биореакторе и погружаются в пациента в течение нескольких часов. Несмотря на то, что биореактор может решить вопрос адресного засеивания клетками, клетки будут оставаться вдоль магистрального сосуда по ходу толщины матрикса из-за недостатка внутриматричных каналов. Хорошие результаты дает метод ретроградной перфузии, в результате чего природный биологический каркас сохраняет свою сложную структуру, белковый состав и механическую целостность. Рецеллюляризация оценивается МТТ-тестом, помимо этого существует широкий спектр методов, доступных для изображения и количественной оценки количества клеток, которые были бы жизнеспособны и способны к пролиферации, такие, как потоковая цитометрия, сканирующая электронная микроскопия, конфокальная микроскопия и др. Часто используется колоромитреческий анализ. Однако, засеивание клетками натуральных трехмерных матриксов представляет дополнительную проблему, сопряженную с количеством ММСК, требующихся для рецеллюляризации. Для получения положительного результата должно быть взаимодействие между натуральными или искусственным матриксом и аутологичными стволовыми клетками в биореакторе. Таким образом, дальнейшее изучение и усовершенствование методик создания биосинтетических каркасов позволит решить некоторые проблемы органной трансплантологии и регенеративной медицины и повысить шансы многих пациентов на выживание.×
References
- Децеллюляризированный матрикс сердца крысы как основа для создания тканеинженерного сердца. А.С. Сотниченко, Е.А. Губарева, И.В. Гилевич, Е.В. Куевда, С.В. Крашенинников, Т.Е. Григорьев, С.Н. Чвалун, П. Маккиарини. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, том VIII, №. 3, 2013. С. 86-94.
- Badylak S.F., Taylor D., Uygun K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds, Annu. Rev. Biomed. 2011; 13: 27-53.
- Fuchs J.R., Nasseri B.A., Vacanti J.P. Tissue engineering: a 21st century solution to surgical reconstruction. Ann. Thorac. Surg. 2001; 72: 577-91.
- Murphy S.V., Atala A. Organ engineering - combining stem cells, biomaterials, and bioreactors to produce bioengineered organs for transplantation. Bioessays. 2012; 35: 163-72.