Features of the reactivity of immunocompetent cells due to the effects of the molecular hydrogen in oral mucositis in the experiment

Full Text

В последние годы в мире наблюдается рост заболеваемости злокачественных образований полости рта. Рак слизистой оболочки полости рта (РСОПР) - злокачественная опухоль, развивающаяся из элементов плоскоклеточного эпителия слизистой оболочки щек, нёба, десен, дна ротовой полости, языка [1]. В России в 2023 году было зарегистрировано более 9 тысяч новых случаев РСОПР [2] Лечение злокачественных новообразований полости рта с использованием лучевой терапии может вызывать побочные эффекты, приводящие к осложнениям, таким как оральный мукозит (ОМ). Это состояние представляет собой повреждение тканей слизистой оболочки ротовой полости и обычно развивается остро, сопровождаясь воспалением тканей органов ротовой полости, языка и гортаноглотки. Пациенты испытывают интенсивную боль, часто описываемую как жжение, что затрудняет прием пищи, разговор и глотание. Болезненные язвы обычно образуются на неороговевших участках слизистой оболочки щек, губ, языка и дна полости рта [3]. Патогенетическое развитие мукозита представляет собой сложный многоступенчатый процесс: под воздействием лучевой терапии наступает стадия инициации, в течение которой происходит прямое повреждение ДНК эпителиальных клеток, что приводит к их гибели и  образованию свободных радикалов, характеризующихся цитотоксическим действием. В ответ на это происходит дисрегуляторное влияние генов на продукцию провоспалительных цитокинов и факторов, регулирующих апоптоз. Увеличение провоспалительных медиаторов (TNF-α, IL-6), сопровождается активацией матриксных металлопротеиназ, приводящих к лизису волокон соединительной ткани. Вследствие каскада воспалительных реакций усугубляется изъязвление, которое характеризуется появлением обширных, глубоких язв в слизистой оболочке. Если инициирующий фактор перестает воздействовать на слизистую, наступает стадия заживления, в процессе которой циклооксигеназа-2 (ЦОГ-2) активно продуцируется фибробластами и эндотелиальными клетками, что способствует восстановлению подслизистого и слизистого слоев. Происходит восстановление скорости обновления эпителия совместно с нормализацией показателей крови и состава микрофлоры окружающих тканей [3, 4]. Поиск новых способов профилактики и лечения постлучевых повреждений слизистой оболочки ротовой полости несомненно, представляет не только научный, но и клинический интерес.

Цель работы. Оценить эффективность применения водного раствора молекулярного водорода (Н2) с целью профилактики и лечения радиационно-индуцированных мукозитов на биомодели крыс в эксперименте.

Материалы и методы исследования. Молекулярный водород (H2) - самый лёгкий и широко известный элемент на Земле, который вызывает живейший интерес учёных как в области энергетики, так и в биомедицине. За последние два десятилетия Н2 зарекомендовал себя как перспективное терапевтическое средство, демонстрируя антиоксидантные и противовоспалительные свойства в многочисленных исследованиях на животных и клинических испытаниях [5]. Молекулярный водород вызывает особый интерес благодаря своей уникальной антиоксидантной активности, проявляя выраженную способность модифицировать окислительный стресс, играющий ключевую роль в развитии множества заболеваний. Окислительный стресс – это дисбаланс между продукцией реактивных форм кислорода (РФК), например, гидроксильного радикала (OH). РФК, представляя собой побочный продукт клеточного метаболизма, в чрезмерном количестве способны наносить ущерб клеточным структурам, в частности, ДНК. Это окислительное повреждение ДНК может приводить к мутациям и развитию онкологических заболеваний. Молекулярный водород выступает в роли эффективного нейтрализатора наиболее активных и опасных свободных радикалов, таких как OH. При этом он практически не взаимодействует с другими, менее вредными формами активных кислородных соединений. Это позволяет избежать побочных эффектов, которые характерны для многих антиоксидантов [5]. Эксперимент по моделированию орального мукозита выполнен в НИИ экспериментальной биологии и медицины ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России. Объектом исследования стали 30 половозрелых самцов крыс породы Wistar, достигших четырёхмесячного возраста и имеющих массу около 200 граммов с допустимым отклонением в 30 граммов. Крысы были разделены на три группы: первая - интактная, имеющая неповрежденную слизистую оболочку полости рта и находившаяся  в условиях стандартного вивария содержания; вторая - экспериментальная, с развившимся мукозитом и ежедневно получавшая раствор молекулярного водорода в виде орошения слизистой на протяжении 14 дней; третья – контрольная, подтверждающая развитие мукозита, но без лечения. Для моделирования лучевого орального мукозита экспериментальным животным был проведен курс дистанционной лучевой терапии на аппарате «Тератрон» с источником ионизирующего излучения, дозой 10 Гр. После 14-суточного наблюдения, фиксации появления симптомов повреждения слизистой, животных подвергались эвтаназии путем передозировки ингаляционным наркозом Изофлуран с помощью ветеринарной наркозной станции с испарителем ТЕС-3. Для проведения морфологического исследования материал оболочек ротовой полости фиксировали в 10% забуференном формалине и после стандартной процедуры пробоподготовки изготавливали тонкие серийные срезы толщиной 2 и 4 мкм в соответствии с требованиям к применяемым методам гистологического окрашивания. При окрашивании гематоксилином и эозином оценивали степень развития повреждений слизистой оболочки, эффекты молекулярного водорода оценивали с помощью иммуногистохимического исследования с детекцией триптазы тучных клеток и поляризационные изменения макрофагов с экспрессией CD68 и CD163 фенотипа. Был проведён количественный анализ гистологических срезов с морфометрией 30 полей зрения на объективе х40 микроскопа Zeiss AxioImagerA2.

Результаты исследования. Макроскопически у всех экспериментальных животных наблюдалось истончение эпителия с возникновением микротрещин и изъязвлений в первые дни после облучения. Гистологический анализ микропрепаратов выявил признаки развивающегося воспаления СОПР: cубэпителиальную нейтрофильно-лимфоцитарную инфильтрацию во всех исследуемых группах. Окрашивание раствором Май-Грюнвальд + Гимза позволило обнаружить очаговые скопления тучных клеток и эозинофилов, преимущественно локализованных периваскулярно и на границе с эпителием. Тучные клетки активно дегранулировали, высвобождая продукты секретома во внеклеточный матрикс и порою образовывали скопления гранул вокруг себя. Группа животных, которым проводили ирригацию водным раствором молекулярного водорода по количественным и функциональным характеристикам тучных клеток имела ряд отличительных признаков. Под воздействием раствора молекулярного водорода активность дегрануляции ТК значительно снижалась, иммуногистохимическое определение триптазы ТК свидетельствовало об ослаблении синтеза триптазы в условиях действия молекулярного водорода. Также обращало на себя внимание уменьшение размеров клеток в сравнении с группой орального мукозита без лечения. Применение раствора молекулярного водорода привело к изменению фенотипа макрофагов на 14 сутки воздействия. Так, в группе без лечения иммуногистохимический анализ макрофагов с антителами к CD 68 показал высокий уровень иммунопозитивных клеток, в то время как фенотип CD 163 макрофагов имел низкие значения (89,2±12,6/17,9±4,2). Эффекты молекулярного водорода индуцировали течение воспалительного процесса с более ранней фазой пролиферации и регенерации. Так, в группе с лечением макрофаги CD 68 количественно были ниже, чем в группе без лечения, а противовоспалительный тип макрофагов значительно преобладал (26,8±9,2/63,6±12,8).

Заключение. Сегодня актуальными и перспективными являются исследования, направленные на изучение различных средств, предотвращающих развитие и/или способствующих более раннему заживлению повреждений эпителиального пласта и соединительнотканной стромы слизистой оболочки полости рта, являющиеся следствием лучевой терапии. Полученные данные показали обнадеживающие результаты применения водного раствора молекулярного водорода с целью профилактики и лечения радиационно-индуцированных реакций со стороны слизистой оболочки ротовой полости. Иммунокомпетентные клетки CD68 [M1], CD163 [M2] и триптаза тучных клеток, известная как воспалительный медиатор являются ключевыми участниками различных морфогенетических процессов, в том числе репарации и поддержания локального гомеостаза, визуализировали положительные эффекты молекулярного водорода (Н2) в патогенезе мукозита ротовой полости. При этом наблюдалось смещение баланса M1/M2 в сторону фенотипа противовоспалительных макрофагов М2, что несомненно является положительным прогностическим критерием в оценке репаративных процессов слизистой оболочки ротовой полости.

About the authors

Maria Rastrosa

Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko

Email: mariya.rastrosa06@mail.ru
ORCID iD: 0009-0008-7216-6137
Russian Federation, 394036, Россия, Воронеж, ул.Студенческая 10

Alina Derevyanko

Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко

Email: davdyan.work@mail.ru
ORCID iD: 0009-0003-4966-1838
Russian Federation, 394036, Россия, Воронеж, ул.Студенческая 10

Victoria Shishkina

Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко

Email: 4128069@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9185-4578

заведующий кафедры гистологии, кандидат медицинских наук 

Russian Federation, 394036, Россия, Воронеж, ул.Студенческая 10

Natalya Korotkikh

Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко

Email: kornat78@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0308-513X

доцент кафедры онкологии, кандидат медицинских наук

Russian Federation, 394036, Россия, Воронеж, ул.Студенческая 10

Irina Grebennikova

Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко

Author for correspondence.
Email: irina_voronezh@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0003-0213-9383

доцент кафедры патологической физиологии, кандидат медицинских наук

Russian Federation, 394036, Россия, Воронеж, ул.Студенческая 10

References

Supplementary files

There are no supplementary files to display.