Morphological diagnosis of breast malignancies: from macroscopic imaging to immunohistochemical examination methods

Full Text

Введение. Макроскопическое строение опухоли описывается врачом-патологоанатомом с учетом морфологии непосредственно опухолевого образования, а также ее локализации и распространении на близлежащие структуры. При описании опухоли указываются ее основные морфологические признаки: поверхность может быть гладкой, папиллярной или бугристой. На разрезе опухолевая ткань имеет бело-серый либо серо-розовый оттенок, иногда из-за наличия кровоизлияний и очагов некроза ткань приобретает пестрый вид. Размеры опухоли зависят от скорости ее роста и тканевого происхождения. Опухоль может располагаться как в толще органа, так и на его поверхности. Также оценивается расстояние от опухоли до ближайших краев резекции: для оценки расположения опухоли относительно различных краев резекции производится окрашивание гистологической краской краев резекции.

Рутинным методом окраски для микроскопического исследования в патологической анатомии является окраска гематоксилином и эозином (ГиЭ). При исследовании препаратов, окрашенных ГиЭ, в злокачественных клетках можно наблюдать увеличение размера как самой клетки и изменение ее формы, так и схожие изменения со стороны ядра – ядерный полиморфизм. Также ядра злокачественных клеток, при окрашивании гематоксилином, имеют более темную окраску относительно интактных ядер, что указывает на повышение концентрации ДНК. Полиморфные ядра имеют неровный контур, крупные ядрышки и нарушенную поляризацию. На этапе исследования материала, окрашенного ГиЭ, можно заметить некоторые характерные черты для отдельных заболеваний [1]. Так, при болезни Педжета в эпидермисе могут находиться относительно светлые клетки, лишенные межклеточных мостиков [2]. После исследования материала в гематоксилине и эозине врачом-патологоанатомом могут быть назначены дополнительные окраски материала и иммуногистохимическое исследование (ИГХ). Так, рак молочной железы (РМЖ) по происхождению опухолевых клеток, а также на основании выявления экспрессии некоторых ИГХ-маркеров, подразделяется на следующие подтипы: люминальные опухоли происходят из люминальных клеток, образующих внутренний слой протоков и долек молочной железы, и базальные, которые расположены на базальной мембране. Соответственно, выделяют подтипы РМЖ:

1. Люминальный А подтип, при котором экспрессируются эстрогеновые рецепторы (estrogen receptor, ER) и/или прогестероновые рецепторы (progesterone receptor, PgR), при этом HER-2 дает отрицательную экспрессию. Маркер митотической активности опухолевых клеток – Ki-67< 20%.

2. Люминальный B подтип, для которого характерна экспрессия ER и/или PgR, при этом HER-2 дает положительную экспрессию. Его маркер – Ki-67 > 13%.

3. HER-2 позитивный, дающий отрицательную экспрессию ER и PgR. Маркер данного подтипа – HER-2 дает положительную реакцию.

4. Базальноподобный, или трижды негативный, подтип, при котором маркеры ER, PgR, HER-2 отрицательные.

При проведении иммуногистохимического исследования особое внимание уделяется маркерам, которые определяют чувствительность опухоли к таргетной, гормональной химиотерапии, а именно к эстрогеновым рецепторам, прогестероновым и HER-2. В каждом случае диагностики РМЖ применяют этот стандартный ряд ИГХ маркеров для определения подтипа опухоли.

Белок p66Shc является еще одним маркером в иммуногистохимии. Он применяется с различными диагностическими и научными целями. В онкопатологии белок p66Shc может служить прогностическим маркером фенотипической активности опухоли. Таким образом, этот белок может входить в расширенную ИГХ-панель при диагностике РМЖ.

В области онкоморфологии актуальной темой является эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) – обратимый процесс изменения фенотипа эпителиальных клеток на мезенхимальный фенотип. При полном ЭМП ключевыми событиями являются распад межклеточных соединений эпителиальных клеток, потеря апикально-базальной полярности, реорганизация цитоскелета, снижение экспрессии эпителиальных генов, Е-кадгерина, цитокератина и активация мезенхимальных генов, которая сопровождается увеличением клеточных выростов и подвижности, а также возможностью разрушения экстрацеллюлярного матрикса для инвазивного поведения [3].

Некоторые опухоли проявляют неполный ЭМП, при котором опухолевые клетки приобретают мезенхимальные свойства, но сохраняют при этом эпителиальные маркеры [4]. При обратном процессе, мезенхимально-эпителиальном переходе (МЭП), клетки, подвергшиеся ЭМП приобретают фенотип эпителиальных клеток. Стандартными маркерами для выявления эпителиального и мезенхимального фенотипов клеток являются Е-кадгерин и виментин соответственно. Е-кадгерин представляет собой белок межклеточной адгезии, который играет критически важную роль в процессе дифференцировки эпителиальных клеток. Ген, кодирующий Е-кадгерин (CDH1), расположен на хромосоме 16q22.1, в области, где часто наблюдаются потери гетерозиготности при спорадических формах рака молочной железы. Е-кадгерин функционирует как супрессор инвазии и опухолевого роста при раке молочной железы. В рамках этого контекста было установлено, что частичная или полная потеря экспрессии Е-кадгерина связана с неблагоприятным прогнозом у пациенток, страдающих от рака молочной железы, так как способствует клеточной пролиферации, инвазии и опухолевой прогрессии. Утрата экспрессии Е-кадгерина сопровождается утратой межклеточных контактов клетками рака молочной железы с другими эпителиальными клетками [5]. Виментин – промежуточный филаментный белок, характерный для мезенхимальных клеток, который играет важную роль в РМЖ. Его повышенная экспрессия ассоциируется с агрессивными формами заболевания, миграцией и инвазией опухолевых клеток. Некоторые исследования показали связь между высоким уровнем виментина и неблагоприятными прогнозами по выживаемости, в то время как другие исследования указывают на отсутствие такой взаимосвязи. Экспрессия виментина может быть связана с тройным негативным подтипом РМЖ, который, как правило, имеют более агрессивное течение. Также одновременная экспрессия промежуточных филаментов виментина и других белков может приводить к изменению клеточного фенотипа и к увеличению способности инвазивного роста клеток. Часто с экспрессией виментина происходит цитоплазматическое и ядерное перераспределение В-катенина. Этот процесс ассоциирован с переходом от эпителильного фенотипа к мезенхимальному, связан с повышением агрессивных свойств эпителиальных клеток. Так как В-катенин может действовать как активатор транскрипции путем связывания с транскрипционными белками, появляется возможность того, что В-катенин напрямую трансактивирует виментин, следовательно он тоже является потенциальным биологическим маркером изменения молекулярного фенотипа эпителиальных клеток в сторону мезенхимального и наращивания злокачественного потенциала рака молочной железы [6].

Клетки, подвергшиеся ЭМП, становятся устойчивыми к старению и апоптозу за счет того, что в механизмах сигнальных каскадов, опосредованных белком, задействованы ферменты фосфоинозитид-3-киназы и серин-треониновой киназ, которые активируют сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR. Данный сигнальный путь повышает клеточную устойчивость к воздействию стрессовых факторов и увеличивает активность роста клеток [7]. Для выявления таких озлокачествленных клеток может быть использован белок p66Shc, который является одной из трех изоформ ShcA, кодируемых геном SHC1.

В раковых клетках молочной железы отмечается повышенный уровень синтеза p66Shc, что может указывать на более высокий метастатический потенциал. Процесс канцерогенеза сопровождается оксидативным стрессом, в процессе которого белок p66Shs, окисляя цитохром С, выделяет активные формы кислорода (АФК) [2]. АФК участвуют в активации онкогенов, изменяют активность митохондрий и усиливают гипоксию, что влияет на построение опухолевого микроокружения [8]. В некоторых других злокачественных опухолях белок p66Shc обладает антионкогенными свойствами, выступая супрессором, который предотвращает выживание и метастазирование раковых клеток, и контролируя уровень АФК в клетке. Увеличение АФК в клетках может приводить к активации путей клеточной смерти, таких как ферроптоз, что помогает сдерживать рост опухолевых клеток [9].

Цель работы обосновать диагностическое значение комплексного иммуногистохимического исследования при раке молочной железы в свете явления эпителиально-мезенхимального и мезенхимального-эпителиального переходов.

Методы и материалы исследования. Было отобрано 10 молочных желез после резекции по поводу РМЖ. Среди отобранных образцов 6 были удалены по поводу люминального подтипа А РМЖ, в то время как 4 по поводу трижды негативного подтипа РМЖ. Была описана макроскопическая характеристика опухолей согласно стандартным характеристикам из протоколов Американского колледжа патологов (College of American Pathologists).

Было отобрано 10 демонстративных срезов злокачественных опухолей в соответствии с определенными критериями: четкое отображение опухолевого узла и зоны инвазии, наличие лимфоваскулярной и периневральной инвазии, а также метастазы в регионарных лимфоузлах, сопровождающиеся как внутренним, так и внешним контролем с положительными и отрицательными образцами.

В качестве контроля использовалось 10 срезов нормальной молочной железы, взятых из незатронутых злокачественным процессов участков отобранных образцов. Для первичного микроскопического исследования срезы были окрашены гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическая реакция была проведена с антителами к p66Shc, виментина и E-кадгерину, где виментин и E-кадгерин служили маркерами мезенхимального и эпителиального фенотипов соответственно. После проведения реакции была осуществлена оценка экспрессии маркеров полуколичественным методом с использованием цветовой шкалы оценки иммуногистохимии.

Результаты исследования. Выявление клеток, подвергшихся ЭМП, является важным диагностическим этапом с точки зрения определения прогноза пациенток. Так, показана различная экспрессия белка p66Shc клетками люминального А и трижды негативного подтипов РМЖ. В рамках реализации программы ЭМП при люминальном А подтипе происходит неполный ЭМП, с чем связана очаговая экспрессия маркера ЭМП – p66Shc. Экспрессия маркеров E-кадгерина и виментина при контроле показывает аналогичную картину. В то же время, более фенотипически агрессивный трижды негативный подтип РМЖ дает диффузную окраску p66Shc на инвазивном фронте, что связано с полным ЭМП в опухоли и большей ее инвазивной способностью. Контроль маркерами E-кадгерином и виментином подтверждают диффузный мезенхимальный фенотип на инвазивном фронте.

Заключение. Область инвазивного фронта опухолевых клеток представляет собой зону формирования ЭМП. В ходе исследования было показано, что в этой области экспрессируются маркеры ЭМП, при этом наблюдается наличие опухолевых клеток мезенхимального фенотипа в той же зоне.

В нормальной ткани молочной железы наблюдается положительная экспрессия E-кадгерина и отрицательная экспрессия виментина эпителиальными клеткам. При раке молочной железы, наоборот, происходит снижение экспрессии E-кадгерина и повышение экспрессии виментина, что говорит о ЭМП. В зависимости от подтипа РМЖ видны отличия в экспрессии белка p66Shc. Такие результаты могут служить основой для введения белка p66Shc в дополнительную ИГХ-панель с целью прогнозирования фенотипической активности того или иного подтипа РМЖ.

About the authors

Svetlana Nikolayevna Achapkina

Petrovsky Medical University "Petrovsky National Research Center of Surgery"

Email: puzar.mila@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0009-3709-6177

student

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, l. Abrikosovsky d.2

Victoria Gnelovna Sarjyan

Petrovsky Medical University "Petrovsky National Research Center of Surgery"

Author for correspondence.
Email: remol_dobronog@mail.ru
ORCID iD: 0009-0007-5554-8988

student

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, l. Abrikosovsky d.2

References

Supplementary files

There are no supplementary files to display.