Pathophysiological aspects of PRP therapy in old age

Full Text

Введение. Репаративная регенерация - важнейший биологический процесс, необходимый для восстановления структуры и функции тканей после повреждения. Патология репаративной регенерации чаще проявляется в виде снижения репаративного потенциала и характеризуется замедлением восстановления и длительным сохранением нарушенных структуры и функции тканей. Такая патология имеет большое значение в хирургии, поскольку реконвалесценция после оперативного вмешательства требует высокого репаративного потенциала, особенно при широком оперативном доступе, например, при лапаротомии [1]. Потому пациенты хирургического профиля имеют высокую потребность в адъювантной терапии, способствующей повышению репаративного потенциала. Одним из методов такой терапии является применение обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP). Известно, что тромбоциты играют важную роль в репаративной регенерации, так как их гранулы содержат большое количество биологически активных веществ, способствующих заживлению: VEGF, PDGF, TGF, IGF, хемокины, фибронектин, витронектин и др. [2, 3]. Однако PRP-терапия имеет широкое разнообразие клинических протоколов при отсутствии рекомендаций к применению в конкретных клинических ситуациях, что является значимым недостатком метода с точки зрения доказательной и персонализированной медицины. Например, учитывая последние данные геронтологии о формировании с возрастом сенесцентного фенотипа [4, 5], эффективность PRP-терапии у лиц пожилого возраста требует дискуссии и исследований, которые позволят адаптировать метод к данной клинической ситуации и обеспечить персонализированный подход к пациентам.

Цель работы. Целью исследования является изучение in vitro влияния PRP пациентов пожилого возраста на репаративный потенциал фибробластов кожи человека (ФКЧ) посредством оценки метаболической, пролиферативной и миграционной активности клеток, а также оценки их жизнеспособности и типа клеточной гибели.

Материалы и методы исследования. PRP получали из цельной крови пациентов пожилого возраста: основная группа №1 (n=10, М/Ж – 5/5, средний возраст Me [IQR]: 64 [62;68]). В группу сравнения №2 (n=10, М/Ж – 5/5, средний возраст Me [IQR]: 36 [33;39]) вошли пациенты молодого возраста. Все пациенты прошли медицинское освидетельствование на предмет отсутствия заболеваний (кроме компенсированных хронических соматических на ранних стадиях) и подписали информированное добровольное согласие (исследование одобрено локальным этическим комитетом МГУ им. Н. П. Огарева). Забор цельной крови осуществляли из периферической локтевой вены при помощи вакуумной системы (игла-бабочка, вакумная пробирка объемом 4,5 мл с цитратом натрия 1:9). Цельную кровь подвергали одноэтапному центрифугированию (270 g, 22°С, 7 минут, 22°С) для разделения на три фракции: эритроциты, лейкоциты и тромбоциты с плазмой. Из каждой пробирки отбирали 1 мл биоматериала из зоны непосредственно над лейкоцитарным кольцом. Аликвоты PRP хранили до 1 месяца при -20°С. В качестве модели для исследования in vitro использовали культуру иммортализованных ФКЧ, предоставленную УНУ ККК ИБР РАН. На экспериментальном этапе использовали PRP в качестве компонента культуральной среды в концентрации 10% в дополнение к DMEM (основной компонент) и пенициллину-стрептомицину (1%). Перед добавлением PRP в культуральную среду активировали тромбоциты физико-химическим способом: размораживание PRP и добавление 10% раствора кальция хлорида с последующим центрифугированием (4000 g, 22°С, 10 мин) для отделения фибрина. В ходе эксперимента инкубировали клетки при температуре 37°С и в атмосфере 5% CO2. Для отрицательного контроля использовали образцы без PRP в культуральной среде. Оценку метаболической активности ФКЧ проводили посредством МТТ-теста: добавляли в образец раствор МТТ в концентрации 5 мг/мл, инкубировали образцы 3,5 часа, добавляли раствор ДМСО для растворения кристаллов формазана, проводили спектрофотометрию при длине волны 570 нм против 650 нм. МТТ-тест проводили трижды через каждые 24 часа после начала эксперимента. Дополнительную оценку метаболической активности ФКЧ проводили посредством АФК-теста, определения активности продукции активных форм кислорода: по реакции окисления 2′,7′-дихлородигидрофлуоресцеин диацетата. Кроме того, оценивали жизнеспособность ФКЧ и определяли тип клеточной гибели посредством флуоресцентной микроскопии с окрашиванием образцов акридиновым оранжевым 100 мкг/мл и йодистым пропидием 100 мкг/мл через 24 после начала эксперимента. АФК-тест проводили трижды через 2, 4 и 24 часа после начала эксперимента. Оценку пролиферативной и миграционной активности ФКЧ проводили посредством scratch assay: кончиком дозатора объемом 200 мкл создавали дефект в монослое клеток, инкубировали образцы 24 часа, фотографировали дефект и оценивали его площадь через 0, 4 и 24 часа после начала эксперимента. Статистическую обработку данных проводили посредством программы StatTech v. 4.1.7.

Результаты исследования. Оценка метаболической активности ФКЧ посредством МТТ-теста выявила наиболее низкую активность в группе пожилого возраста на всех сроках наблюдения, при этом в первые сутки эксперимента отмечено снижение данного показателя в группе №1 на 85,5% (p<0,05) по сравнению с группой №2 и контролем, где данные показатели были сопоставимы. Активность продукции активных форм кислорода в основной группе по результатам АФК-теста продемонстрировала вдвое более высокие показатели по сравнению с контролем (в первые 4 часа, к концу 1 суток – снижение на 42%) при одинаковой динамике в этих группах – плавное нарастание показателя в интервале 0-4 часа и резкое возрастание показателя к концу 1 суток. Тем не менее, этот же показатель в группе сравнения был выше в 2-3 раза (в первые 4 часа, к концу 1 суток – снижение на 66%) с иной динамикой – пик отмечен через 2 часа после начала эксперимента. Оценка жизнеспособности ФКЧ и определение типа клеточной гибели выявила следующие данные: в основной группе – 79% жизнеспособных клеток и 21% нежизнеспособных (типы клеточной гибели – 15% апоптоз, 1% некроз), в группе сравнения – 93% жизнеспособных и 7% нежизнеспособных (7% апоптоз), в контроле – 92,5 жизнеспособных и 8% нежизнеспособных (7% апоптоз, 1% некроз), то есть снижение жизнеспособности ФКЧ в основной группе на 15% и повышение частоты апоптоза более чем вдвое. Scratch assay не выявил достоверных межгрупповых различий: во всех группах отмечены пролиферативная и миграционная активность, закрытие дефекта на 64-68% к концу 1 суток и закрытие дефекта полностью к концу 2 суток.

Заключение. Результаты исследования продемонстрировали, что PRP, полученная из биоматериала пациентов пожилого возраста, имеет ряд негативных эффектов на ФКЧ in vitro. Отмечено значительное снижение метаболической активности, в т. ч. продукции активных форм кислорода, снижение жизнеспособности и повышение частоты апоптоза клеток. При этом не выявлено изменения пролиферативной и миграционной активности. Следует отметить, что выявленные эффекты характерны и/или наиболее выражены в первые сутки, и являются адаптивной реакцией ФКЧ на изменение культуральной среды (добавление PRP). Тем не менее, очевидно, что адаптация клеток к PRP пациентов пожилого возраста протекает труднее, чем к PRP пациентов молодого возраста. Это соответствует приведенным в литературе данным, согласно которым старение сопровождается формированием сенецентного фенотипа, элементы которого присутствуют в крови, что снижает качество биоматериала для получения PRP и, следовательно, качество самой PRP. На фоне полученных данных интерес представляет количественная оценка PRP пациентов старшего возраста в сравнении с PRP пациентов младшего возраста с определением концентраций биологически активных веществ как основного эффекторного фактора данного препарата.

About the authors

Konstantin S. Madonov

Ogarev Mordovia State University

Author for correspondence.
Email: MKS-34@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3709-1458
SPIN-code: 9919-6959

young lecturer of the department of normal and pathological physiology

Russian Federation, 430005, Russia, Republic of Mordovia, Saransk, Luhovka, st. Sadovaya, 268

Ivan V. Kizorkin

Ogarev Mordovia State University

Email: ivkizorkin@mail.ru
ORCID iD: 0009-0003-0764-794X
Russian Federation, 430005, Russia, Republic of Mordovia, Saransk, Luhovka, st. Sadovaya, 268

Vladimir I. Fomin

Ogarev Mordovia State University

Email: fominvova20003@gmail.com
ORCID iD: 0009-0005-1051-3162
430005, Russia, Republic of Mordovia, Saransk, Luhovka, st. Sadovaya, 268

Leonid A. Isaev

Ogarev Mordovia State University

Email: leonidisaev07@gmail.com
ORCID iD: 0009-0005-2514-4582
430005, Russia, Republic of Mordovia, Saransk, Luhovka, st. Sadovaya, 268

Egor S. Pivkin

Ogarev Mordovia State University

Email: pivkin.2003@list.ru
ORCID iD: 0009-0002-0760-4416
430005, Russia, Republic of Mordovia, Saransk, Luhovka, st. Sadovaya, 268

References

Supplementary files

There are no supplementary files to display.