Прикладные информационные аспекты медицины

2070-9277

Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko - The State Budgetary Institution of Higher Professional Education «Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko» of the Ministry of Public Health of the Russian

11001

10.18499/2070-9277-2025-28-3-77-84

Western blot analysis as a method of control of the effectiveness of HEK293-SLCO1B3 cell transfection

Abalenikhina

Julia Vladimirovna

Doctor of Medical Sciences, Associate Professor, Professor of the Department of Biological Chemistry, Leading Researcher at the Central Research Laboratoryabalenihina88@mail.ruSchulkin

Alexey Vladimirovich

Doctor of Medical Sciences, Associate Professor, Professor of the Department of Pharmacology, Leading Researcher at the Central Research Laboratoryalekseyshulkin@rambler.ruAnanyeva

Pelageya Dmitrievna

PhD, Assistant Professor of the Department of Pharmacology, Junior Researcher at the Laboratory of Cell Technologies at the Central Research Instituteerokhina.pelageya96@yandex.ruMylnikov

Pavel Yurievich

PhD, Associate Professor of the Department of Pharmacology, Junior Researcher at the Laboratory for the Study of Drug Pharmacokineticsdukeviperlr@gmail.comSolotnova

Svetlana Olegovna

Research Assistant at the Molecular Genetics Laboratorysvetundro@yandex.ruZacarinnaya

Ekaterina Andreyevna

Junior Researcher at the Molecular Genetics Laboratorymicrobiog@mail.ruYakusheva

Elena Nikolaevna

Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department of Pharmacologye.yakusheva@rzgmu.ru

Ryazan State Medical University of the Ministry of Health of Russia

09112025

2837784

01102025

2025

The article presents a protocol for detecting the OATP1B3 (SLCO1B3) transporter in HEK293-SLCO1B3 transfected cell lines using the western blot method. The article discusses the preparation of samples, the conditions for electrophoresis, and the interpretation of results for this membrane protein. The study also includes the validation and calibration of the western blot method using chemiluminescence in Hek293-SLCO1B3 transfected cell lines. During the work, it was proved that in order to obtain reproducible results, it is necessary to use freshly prepared lysates at a dilution of 5-20 g/well, and to use the results in the linear range for the interpretation of quantitative analysis.

western blot, Hek293-SLCO1B3, transporter protein, transfection

вестерн-блот, Hek293-SLCO1B3, белок-транспортер SLCO1B3, трансфекция.

Актуальность. Вестерн-блот анализ (вестерн-блоттинг, иммуноблот, western blot) активно используется для детекции специфических белков и их пострансляционной модификации в биологических образцах (клетки, ткани, биологические жидкости). В настоящее время наличие современных методов детекции бендов (хемилюминисценция и флуоресценция) и способов их анализа позволяет не только визуализировать полученные данные, но и проводить количественную оценку. При количественном анализе используются изображения, полученные с помощью детектирующей системы, и содержание белка измеряется по оптической плотности, вычисляемой на основе интенсивности полосы (бенда) с поправкой на фон. В норме показатели оптической плотности пропорциональны содержанию белка, поэтому выражаются в виде линейной регрессии, но бывают отклонения и данные представляются гиперболической функцией [1]. Определение подходящей математической модели для анализа данных имеет решающее значение для достоверной интерпретации данных [2]. Следует учитывать, что при насыщении пробы белком, независимо от системы детектирования, увеличение содержания белка не может быть обнаружено и/или измерено адекватно. В таком случае количественный анализ данных нецелесообразен, так как различия в содержании белка в образцах могут быть не учтены, что приведет к ложноотрицательным результатам. Чаще всего при выполнении количественного анализа уровни целевого белка нормализуют до уровней контрольного белка, содержание которых не меняется между сравнениями. Трансфекция клеток ключевая технология в молекулярной биологии, требующая надежных методов контроля. Вестерн-блоттинг имеет ряд преимуществ это определение уровня целевого белка по молекулярной массе и возможность количественной оценки. Полипептид, транспортирующий органические анионы, 1B3 (англ. organic anion transporting polypeptide 1B3, OATP1B3) важный мембранный транспортный белок печени, участвующий в захвате эндогенных соединений и лекарственных веществ [3]. Исследование его экспрессии нуждается в специальных подходах из-за низкого уровня естественной экспрессии и гликозилирования (мол. масса 60-85 кДа). Вестерн-блоттинг служит важным инструментом для оценки успешности трансфекции клеточных культур. В статье рассматриваются методические подходы к использованию вестерн-блоттинга для контроля синтеза белка в результате трансфекции клеток соответствующим геном. Расширение знаний о количественной оценке методом вестерн-блот позволит более точно использовать эту технологию для получения значимых данных и, следовательно, приведет к рутинному включению валидационных аспектов в практику. Цель исследования аалидировать и адаптировать метод вестерн-блот для детекции целевого белка OATP1B3 в трансфицированных клетках HEK293-SLCO1B3. Материал и методы исследования. Экспериментальная работа in vitro была выполнена на культуре клеток почек человеческого эмбриона НЕК293 (англ.: human embryonic kidney) и трансфицированной клеточной линии HEK293-SLCO1B3. Для создания рекомбинантной клеточной линии использовались клетки линии HEK293 (ФГБУН ИНЦ РАН, Санкт-Петербург). С помощью методов генной инженерии конструировали плазмиду с геном SLCO1B3, кодирующим транспортер OATP1B3, затем с помощью липофектамина 3000 проводили трансфекцию клеток и селекцию полученных клонов. Трансфицированная клеточная линия HEK293-SLCO1B3, стабильно экспрессирующая ОАТР1B3, была получена в лаборатории биоинженерии клеток ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России по оригинальной методике [4]. НЕК293 HEK293- SLCO1B3 Рис. 1. Изображения клеточных культур НЕК293 и HEK293- SLCO1B3, выполненнные с помощью, микроскопа Олимпус CKX-53, ув. 400 Клетки НЕК293 и HEK293-ОАТР1B3 культивировали в 6-луночных планшетах в питательной среде DMEM, содержащей глюкозу 4500 мг/л, L-глутамин (4 мМ), пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) (Панэко, Россия), эмбриональная бычья сыворотка (10 %) (Biowest, France) при содержании СО2 5%, температуре 37С в инкубаторе WS-189C (World Science, Корея). Для анализа формировали следующие группы трансфицированных клеткок с содержанием белка при разведении: первая группа 5 мкг/лунка; вторая группа 10 мкг/лунка; третья группа 20 мкг/лунка; четвертая группа 30 мкг/лунка; пятая группа 50 мкг/лунка. После формирования клеточного монослоя клетки снимали с лунок планшета раствором трипсин-ЭДТА (0,25%:0,2%), далее осуществляли трехкратную промывку раствором фосфатного буфера (ПанЭко, Россия). Лизис клеток проводили коммерческим буфером RIPA 100 мкл на 107 клеток (Servicebio, Китай), содержащим смесь ингибиторов протеиназ (Sigma-Aldrich, Германия) в течение 30 мин при t=+4С, перемешивая каждые 10 мин. По окончании инкубации клеточный лизат подвергали центрифугированию при 5000 g (CM-50, Eppendorf, Германия) в течение 15 мин. В лизатах клеток HEK293-SLCO1B3 оценивали уровень белка-транспортера OATP1B3 методом вестерн-блот по стандартному протоколу [1]. Для анализа образцы смешивали с буфером Laemmli (v1:v2), содержащем 2-меркаптоэтанол (50 мМ, BioRad, США), инкубировали 10 мин при температуре 70C. Объем вносимого образца в гель составлял 20 мкл, содержание общего белка согласно указанным разведениям. Вестерн-блот анализ включал следующие этапы. Электрофорез (SDS-PAGE). Разделение белков по молекулярной массе в полиакриламидном геле [5]. Для проведения электрофореза использовали источник тока EPDU 400 (Китай). Электрофорез проводили при напряжении 100 В, силе тока 25 А в течение 90 мин. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану. Далее белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мкм) полусухим способом с помощью автоматической системы Fast Semi-Dry (Китай), используя буфер для переноса Transfer Buffer (США) и режим работы для белков средней молекулярной массы. Блокировка мембраны с помощью блокирующего раствора. Блокировка белков на мембране осуществлялась в течение 30 мин в блокировочном буфере (Servicebio, Китай) с добавлением 0,1% Tween-20 (Servicebio, Китай). Связывание с антителами. Инкубация с первичными антителами для ОATP1B3 и GAPDH (Affinity, Китай) составляла 12 ч при температуре +4◦С, далее осуществляли 3-кратную промывку трис-буфером с добавлением твина-20 (англ.: Tris-buffered saline tween, TВST) для удаления не связавшихся антител. Затем к мембране добавляли вторичные антитела для ОATP1B3 и GAPDH (Affinity, Китай) на 1 час при комнатной температуре. Детекцию белков осуществляли хемилюминесцентным методом на приборе ChemiScope (Китай). Интенсивность полученных полос анализировали денситометрически с помощью программного обеспечения ChemiScope. Данные обрабатывали с использованием программного обеспечения StatSoft Statistica 13.0, Microsoft Excel и GraphPad Prism 8. Полученные результаты оценивали тестом ANOVA (дисперсионным анализом). Для попарного сравнения всех серий post-hoc Тьюки. Результаты представлены на графиках в виде среднего арифметического значения и стандартного отклонения (MSD). Статистически значимыми считали различия при р 0,05. Полученные результаты и их обсуждение. Cерийные разведения клеточных лизатов трансфецированных клеток HEK293-SLCO1B3 разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Количество белка OATP1B3 оценивали с помощью специфичных поликлональных антител, детекцию проводили химилюминисцентным способом в течение 30 сек. Данные анализа насыщения бендов были проанализированы путем сравнения гиперболической модели с линейной. Полученные результаты в диапазоне концентраций 5-100 мкг/лунка соответствовали гиперболической модели, а не линейной. Данный факт указывает на то, что пробы становились насыщенными по мере увеличения количества лизата, добавляемого в лунки геля (рис. 2А). Линейная область была определена в диапазоне рабочих концентраций 5-20 мкг/лунка (рис. 2А, красная прямая), а при концентрациях 50-100 мкг/лунка получено, что содержание белка выходит на плато (рис. 2, прямоугольная область). Рис. 2. Математическая зависимость содержания целевого белка OATP1B3 (A) и белка домашнего хозяйства GAPDH (Б) при различных разведениях лизатов клеток HEK293-SLCO1B3. Известно, что зафиксированные данные денситометрического анализа напрямую соответствуют содержанию белка только в том случае, если соответствуют прямой пропорциональной линейной модели. Так разведения белка GAPDH имеют линейную зависимость (рис. 2Б). В рутинной практике после детекции белков проводят нормализацию на белок домашнего хозяйства, в нашем исследовании это GAPDH. Нормализацию данных осуществляли путем соотношения результатов денситометрического анализа специфического белка OATP1B3 к GAPDH. Следовательно, при нормализации данных целевого (специфического) белка на GAPDH были получены следующие результаты. В области линейной зависимости разведения клеточного лизата 5-10 мкг/лунка относительное количество OATP1B3 не изменялось и незначительно снижалось при разведении 20 мкг/лунка на 12,6% (р=0,028) и 14,3% (р=0,013) относительно разведений 5 мкг/лунка и 10 мкг/лунка соответственно (рис. 3). При линейном повышении GAPDH и нелинейной зависимости содержания OATP1B3, при подсчете соотношения было зафиксировано снижение относительного количества целевого белка относительно разведения 5 мкг/лунку на 35,3% (р0,0001) и 66,0% (р0,0001); относительно разведения 10 мкг/лунка на 36,6% (р0,0001) и 66,7% (р0,0001), относительно разведения 20 мкг/лунка на 26,5% (р0,0001) и 61,4% (р0,0001) при разведениях 50 и 100 мкг/лунка соответственно. Между разведениями 50 и 100 мкг/лунка было зафиксировано снижение относительного количества OATP1B3 на 47,4% (р0,0001) (рис. 3). Рис. 3. Результаты вестерн-блот анализа: фото бендов OATP1B3, GAPDH (A) и относительное количество OATP1B3 (Б). Примечание: статистически значимые различия обозначены * - р0,05; *** - р0,001; **** - р0,0001 относительно соответствующей группы сравнения. Установлено, что относительное количество не изменялось между разведениями 50 и 100 мкг/лунка, что указывает на нецелесообразность проводить анализ в указанном диапазоне и нормализовать данные оптической плотности целевого белка путем деления их на значения оптической плотности контрольных белков, если результаты не соответствуют пропорциональным линейным моделям. Визуальный осмотр вестерн-блотов (рис. 2) позволяет предположить, что насыщение данных оптической плотности может быть связано с измерением интенсивности полос. Однако отсутствие линейности оптической плотности привело к ложноотрицательным результатам при делении на GAPDH, изменение уровня которого было линейным. Таким образом, вестерн-блоты, которыепоказывают слабые полосы, непригодныдляколичественныхсравнений, посколькуденситометриянедастнадежныхпоказателейсодержаниябелка. А появление ореолов и размытостей связаноспереизбыткомцелевогобелка,егоследуетустранятьпутемуменьшенияколичествализата,добавляемоговгелиSDS-PAGE. По результатам нашей работы, очевидно, что перегрузка лунки геля целевым белком приводит не только к математическому искажению данных, но и затрудняет оценку пострансляционной модификации отсутствие или нечеткое изображение второго бенда на снимке, что повлечет неправильную интерпретацию данных. Иммуноблоттинг в сочетании с цифровым анализом изображений является современным и надежным методом анализа количества белков и их модификаций, однако проведенный эксперимент не всегда дает точный результат. Подготовка образцов, пошаговое соблюдение протокола, а также подход к нормализации существенно влияют на количественные показатели иммуноблоттинга. Результаты приведенного исследования демонстрируют, что для анализа данных, полученных методом вестерн-блот необходимо выполнять калибровку разведений с целью подбора оптимальных условий проведения эксперимента и точности интерпретируемых результатов. Игнорирование данной подготовки повлечет за собой псевдоколичественные данные иммуноблота, которые заметно завышают или недооценивают истинные различия в содержании белка [6]. Важным моментом при проведении количественного иммуноблоттинга является загрузка белка и контроля загрузки [7]. При выполнении экспериментальных работ in vitro нормализация количества клеток в образцах является сложной задачей, поскольку трудно оценить изменения в пролиферации и гибели клеток в различных условиях, а также сложно учесть различия в начальной плотности посева и конечных объемах лизата, которые влияют на наблюдаемое содержание белка. Следовательно, образцы для иммуноблоттинга часто готовят в соответствии с общим количеством клеточного белка [8], предполагая, что среднее содержание белка в клетке постоянно в различных условиях. С целью дополнительной оценки содержания общего белка обычно включают загрузку контрольных белков (-актин, глицеральдегидфосфат-дегидрогеназа, тубулин, р38), что обеспечивает проверку добавления равного количества клеточного материала [9]. Использование контроля возможно в том случае, если содержание белка примерно постоянно в различных условиях, а также интенсивность полос иммуноблоттинга линейно отражает его содержание. Общепринятый подход, встречающийся в литературе, заключаетсявнормализации по белку [9]. Тем не менее в этом случае количество интересующего белка является одним неизвестным, которое делят на содержание общего белка - другоенеизвестное, что приводит к нормализации по одной переменной. Статистическая опасностьнормализации по однойпеременнойвыявленавданных, полученных с помощью количественнойполимеразнойцепнойреакции(ПЦР) [10], и имеет место при анализе данных вестерн-блота. Следовательно, требуется выполнение многократного контроля, что позволит рассчитать среднее содержание специфического белка в клетках, котороеменеечувствительноктехническимилибиологическимколебаниям. В экспериментальных условиях была исследована линейная зависимость содержания белка OATP1B3 и GAPDH. Проведенная экспериментальная работа позволила оценить перезагрузку в лунки геля, линейность данных и погрешность нормализации в условиях эксперимента, в которых проводятся типичные вестерн-блоттинговые сравнения. Все ошибки нормализации, обнаруженные в представленном исследовании, свидетельствуют о том, что точная оценка различий в содержании белка может быть произведена после калибровки экспериментов вестерн-блоттинга. Каждый специфический белок имеет различную линейность и/или диапазон детектирования в различных сериях разведений, что следует учитывать при планировании экспериментов. Выводы. Вестерн-блоттинг является удобным методом для контроля трансфекции клеток, обладающий высокой специфичностью, возможностью количественного анализа. Развитие количественного анализа с помощью метода вестерн-блот позволяет повысить точность анализа целевого белка при транфекциях. Однако для получения достоверных результатов необходимо тщательно оптимизировать условия эксперимента и проводить калибровку вестерн-блотинга. Представленный протокол калибровки позволяет эффективно детектировать OATP1B3 после трансфекции в клетках HEK293-OATP1B3. Соотношение целевой показатель/контрольные показатели загрузки используется для сравнения, и разница между образцами соответствует разнице в содержании целевого белка только в том случае, когда данные денситометрического анализа соответствуют моделям прямой линейной пропорциональной зависимости. Для получения воспроизводимых результатов необходимо использовать свежеприготовленные лизаты в разведении 5-20 мкг/лунка.

1. Butler T. A. J. Misleading Westerns: Common Quantification Mistakes in Western Blot Densitometry and Proposed Corrective Measures / T. A. J. Butler, J. W. Paul, E. C. Chan, R. Smith, J. M. Tolosa // Biomed Res Int. – 2019. – Vol. 2019. – P. 5214821.

2. Taylor S. C. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data / S. C. Taylor, T. Berkelman, G. Yadav, M. Hammond // Mol Biotechnol. – 2013. – Vol. 55, No 3. – P. 217–226.

3. Pan Q. Organic Anion Transporting Polypeptide (OATP) 1B3 is a Significant Transporter for Hepatic Uptake of Conjugated Bile Acids in Humans / Q. Pan, G. Zhu, Z. Xu, J. Zhu, J. Ouyang, Y. Tong, N. Zhao, X. Zhang, Y. Cheng, L. Zhang, Y. Tan, J. Li, C. Zhang, W. Chen, S. Y. Cai, J. L. Boyer, J. Chai // Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. – 2023. – Vol. 16, No 2. – P. 223-242.

4. Котлярова М. С. Создание клеточной линии, селективно продуцирующей функционально активный транспортер OATP1B1 / М. С. Котлярова, А. В. Щулькин, П. Д. Ерохина [и др.] // Биохимия. – 2023. – Т. 88, № 9. – С. 1536–1544. [Kotliarova M. S. Generation of a Cell Line Selectively Producing Functionally Active OATP1B1 Transporter / M. S. Kotliarova et al. // Biochemistry (Moscow). – 2023. – Vol. 88, No 9. – P. 1267-1273.]

5. Общая фармакопейная статья. Электрофорез в полиакриламидном геле : утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749 : ОФС.1.2.1.0023.15 // Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том I. – Москва, 2018. [General Pharmacopoeial Monograph. Polyacrylamide Gel Electrophoresis: approved and put into effect by the Order of the Ministry of Health of Russia No. 749 of October 31, 2018 : OFS.1.2.1.0023.15 // State Pharmacopoeia of the Russian Federation. XIV edition. Volume I. – Moscow, 2018.]

6. Janes K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting / K. A. Janes // Sci Signal. – 2015. – Vol. 8, No 371. – P. rs2. doi: 10.1126/scisignal.2005966.

7. Marcus E. Credibility and reproducibility / E. Marcus // Cell. – 2014. – Vol. 159, No 5. – P. 965–966.

8. Olson B. J. Assays for determination of protein concentration / B. J. Olson, J. Markwell // Curr Protoc Protein Sci. – 2007. – Chapter 3, Unit 3.4.

9. Nie X. An appropriate loading control for western blot analysis in animal models of myocardial ischemic infarction / X. Nie, C. Li, S. Hu, F. Xue, Y. J. Kang, W. Zhang // Biochem Biophys Rep. – 2017. – Vol. 12. – P. 108–113.

10.

10. Tricarico C. Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction: normalization to rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human tissue biopsies / C. Tricarico, P. Pinzani, S. Bianchi, M. Paglierani, V. Distante, M. Pazzagli, S. A. Bustin, C. Orlando // Anal Biochem. – 2002. – Vol. 309. – P. 293–300.