Прикладные информационные аспекты медициныПрикладные информационные аспекты медицины2070-9277Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko - The State Budgetary Institution of Higher Professional Education «Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko» of the Ministry of Public Health of the Russian1096910.18499/2070-9277-2025-28-2-53-59POSSIBILITIES OF MODELING ENDOTHELIAL-MESENCHYMAL TRANSITION IN PRIMARY ENDOTHELIAL CELL CULTURES IN VITROStrelnikovaЕкатерина Andreyevna<p>Junior Research Fellow at the Central Research Laboratory</p>ekaterina3333@rambler.ruKalininRoman Evgenievich<p>MD, Professor, Head of the Department of Cardiovascular, X-ray Endovascular Surgery, and Radiation Diagnostics</p>glms.rokptd@mail.ruSuchkovIgor Александрович<p>MD, Professor of the Department of Cardiovascular, X-ray Endovascular Surgery, and Radiation Diagnostics</p>i.suchkov@rzgmu.ruAbalenikhinaJulia Vladimirovna<p>Doctor of Medical Sciences, Associate Professor, Professor of the Department of Biological Chemistry</p>Abalenihina88@mail.ruMzhavanadzeNina Jansugovna<p>Doctor of Medical Sciences, Associate Professor, Professor of the Department of Cardiovascular, X-Ray Endovascular Surgery and Radiation Diagnostics, Chief Researcher at the Central Research Institute</p>nina_mzhavanade@mail.ruRyazan State Medical University named after Academician I.P. Pavlov of the Russian Ministry of Health09112025282535908072025Copyright © 2025, Applied Information Aspects of Medicine (Prikladnye informacionnye aspekty mediciny)2025<p>The aim of the study was to evaluate the prospects/likelihood/feasibility of in vitro endothelial-mesenchymal transition (endothelial-mesenchymal transition, EndMT) studies in primary human umbilical vein endothelial cell cultures (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) using specific concentrations and time of TGF1 expression.</p> <p>Material and methods. The study was conducted on primary human umbilical vein endothelial cell culture HUVEC passage 3. Primary HUVEC cultures were cultured in ECGM culture medium for 3 days until a monolayer was formed, after which the nutrient medium was changed to serum-free DMEM F-12 medium for 3 hours. Then, HUVEC culture cells were incubated with recombinant human TGF-1 (10 ng/ml) at 37C for 72 hours. At the end of TGF-1 exposure, the relative amounts of proteins characteristic of EndMT are obtained in cell lysates using Western blotting techniques: endothelial markers - cell adhesion molecules and platelets to endothelial cells-1 PECAM-1 (CD31) and von Willebrand factor (von Willebrand factor, vWF), as well as mesenic markers - fibronectin (fibronectin, FN), vimentin. (vimentin, VIM).</p> <p>Results. The study found that exposure of the liver to TGF-1 at a dose of 10 ng / ml for 3 days on the primary culture of HUVEC led to a significant decrease in the amount of CD31 by 45.4% and vWF by 34.3% compared to the control, confirmed by the services for confirming the loss of characteristic endothelial cell markers (r 0.05). Exposure of primary HUVEC culture to TGF-1 for 72 h significantly increased the relative amount of FN by 43.3% and VIM by 50.7% relative to the control (p0.05), indicating the formation of endothelial cells with mesenchymal characteristics.</p> <p>Conclusions. Exposure of primary HUVEC culture to human recombinant TGF-1 in patients at 10 ng/ml for 3 days allows for reliable induction of EndMT in vitro, which is a statistically significant decrease in the relative amount of endothelial markers EndMT CD31 and vWF and a relative increase in the amount of mesenchymal markers FN and VIM in cultured cell lysates.</p>endothelial-mesenchymal transition (Endothelial-mesenchymal transition, EndMT), human transforming factor beta 1 (TGF-β1), von Willebrand factor (von Willebrand factor, vWF), platelet-endothelial cell adhesion molecule-1 PECAM-1 (CD31), fibronectin (fibronectin, FN), vimentin (vimentin, VIM), primary endothelial cell culture HUVEC.эндотелиально-мезенхимальный переход (Endothelial-mesenchymal transition, EndMT), человеческий трансформирующий фактора бета 1 (TGF-β1), фактор фон Виллебранда (von Willebrand factor, vWF), молекула клеточной адгезии тромбоцитов к эндотелиальным клеткам-1 PECAM-1 (CD31), фибронектин (fibronectin, FN), виментин (vimentin, VIM), культура первичных эндотелиоцитов HUVEC.<p><strong><em>Актуальность.</em></strong> Эндотелиально-мезенхимальный переход (Endothelial-mesenchymal transition, EndMT) был впервые описан в эндокардиальных подушках сердца эмбриона Markwald et al. [1]. EndMT приводит к молекулярным и структурным перестройкам, которые вызывают изменения в клетках, необходимые для перехода к мезенхимальному фенотипу. Эндотелиально-мезенхимальный переход динамический процесс, в котором эндотелиальные клетки подавляют эндотелиальные свойства и приобретают характеристики мезенхимальных клеток. На начальных стадиях эндотелиоциты ослабляют свои межклеточные соединения, разрушают базальную мембрану и мигрируют в периваскулярную среду [2]. Отличительными особенностями EndMT являются утрата эндотелиоцитами специфических микровезикул, содержащих фактор фон Виллебранда (von Willebrand factor, vWF) [3]. Также происходит подавление молекул адгезии, таких как сосудистый кадгерин (vascular endothelial cadherin, VE-cadherin (CD144) [4], молекула клеточной адгезии тромбоцитов к эндотелиальным клеткам-1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule 1, PECAM-1 (CD31) [5]. Ослабление адгезионных свойств приводит к повышению клеточной миграции, вследствие чего происходит увеличение MMP (матриксных металлопротеиназ), и повышение миофибробластических маркеров, таких как -гладкомышечный актин (аlpha-smooth muscle actin, -SMA) [6], виментин (vimentin, VIM) [7] и фибронектин (fibronectin, FN) [8]. Следовательно, EndMT приводит к снижению эндотелиальных свойств, таких как цитокин-индуцированная адгезия лейкоцитов и образование сосудов, а также к увеличению мезенхимальных свойств, например, отложение коллагена и сократительная способность.</p> <p>EndMT является важным регулятором физиологических и патологических процессов в организме человека. Индукция EndMT может быть вызвана напряжением сдвига в сосудах, факторами воспаления, опухолевым ростом и многими другими причинами. Ключевым индуктором EndMT является трансформирующий фактор роста бета transforming growth factor beta 1 (TGF-1) [9].</p> <p>При анализе литературы стало понятно, что описанные методики предлагают широкий диапазон условий: различные сроки экспозиции, преинкубации и концентрации индуктора [10,11,12]. Опираясь на существующие протоколы, мы разработали оригинальный протокол комбинации параметров для моделирования TGF-1-индуцированного EndMT в лаборатории клеточных технологий ЦНИЛ. Отличительной особенностью стало уменьшение времени инкубации культуры эндотелиоцитов в среде для преинкубации до 3-х часов, так как при более длительных сроках жизнеспособность клеток снижалась, а также использование строго определенных концентрации (10нг/мл) и времени экспозиции (3-е суток) человеческим рекомбинантным TGF-1.</p> <p>Основным регулятором EndMT является передача сигналов TGF-. Все изоформы TGF- 1, 2 и 3 могут индуцировать EndMT. Однако точная роль каждой изоформы может различаться [13]. Важность передачи сигналов TGF- в индукции EndMT была продемонстрирована в нескольких исследованиях in vivo.</p> <p>Трансформирующий фактор роста (TGF)- многофункциональный цитокин, экспрессируемый практически всеми видами тканей и клеток. TGF- сигналинг регулирует множество клеточных реакций в процессах эмбриогенеза, заживления ран, тканевого и иммунного гомеостаза. Дисфункция TGF- вносит значительный вклад в патогенез различных заболеваний.</p> <p>В сердечно-сосудистой системе трансдукция TGF- повышена при фиброзе миокарда, клапанов сердца и атеросклероза. Это обусловлено деятельностью стромальных мышечных клеток (smooth muscle cells, SMC), фибробластов, эндотелиоцитов и воспалительных клеток, таких как макрофаги [14]. TGF- играет двойственную роль и может как стимулировать фибробласты к дифференцировке в миофибробласты, производить компоненты внутриклеточного матрикса (ВКМ) и ремоделировать сосудистую стенку, так и индуцировать EndMT в эндотелиальных клетках, вызывая фибробластический фенотип [15, 16]. Повсеместная экспрессия TGF- в организме убедительно указывает на его критическую и множественную роль в физиологических процессах.</p> <p>Цель нашего исследования оценить перспективу in vitro моделирования эндотелиально-мезенхимального перехода в первичных эндотелиоцитах HUVEC с использованием определенных концентрации и времени экспозиции TGF1.</p> <p><strong><em>Материал и методы исследования. </em></strong>Выделение первичных культур HUVEC.</p> <p>Исследование было выполнено на первичной культуре эндотелиальных клеток вены пуповины человека HUVEC, выделенных из сегментов пуповин здоровых женщин-доноров, подписавших добровольное информированное согласие. Научная работа была одобрена локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России (протокол №2, от 16.09.2022). Полученный биологический материал доставляли в лабораторию клеточных технологий РязГМУ, где выделяли первичную культуру эндотелиальных клеток по протоколу Crampton (2007) [17]. Вену пуповины промывали физиологическим раствором от кровяных сгустков, в просвет сосуда вводили раствор 0,1% коллагеназы (кат. № GC305013-1g, Servicebio, Китай), края сосуда зажимали и инкубировали при температуре 37℃ в течение 15 минут. После инкубации вену промывали теплым фосфатно-солевым буферным раствором DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline, кат. № Р061Е, ПанЭко, Россия) над пробиркой, затем центрифугировали, а клеточный осадок высаживали на предварительно желатинизированный культуральный пластик (кат. № 70025', SPL Lifesciences, Китай) [18].</p> <p>Затем первичные культуры эндотелиальных клеток вены пуповины человека (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) культивировали в ростовой среде для эндотелиоцитов ECGM (Endothelial Cell Growth Medium, кат. № 211-500, Целл апликацион). Далее моделировали EndMT путем добавления рекомбинантного человеческого TGF-1.</p> <p>Моделирование EndMT в первичной культуре эндотелиоцитов HUVEC.</p> <p>Первичные культуры HUVEC засеивали в 6-луночные планшеты (кат. № 30006', SPL Lifesciences, Китай) в количестве 3х105 клеток на лунку и культивировали в течение 3 суток до образования монослоя. Затем выполняли смену питательной среды на бессывороточную среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко с добавлением питательных веществ (F-12) (DMEM F-12) (кат. № С470Е, ПанЭко, Россия) в течение 3-х часов. Далее клетки инкубировали с рекомбинантным человеческим TGF-1 (10 нг/мл) при 37C в течение 72 часов.</p> <p>Подтверждение индукции EndMT в первичной культуре эндотелиоцитов HUVEC</p> <p>По истечении времени инкубации с TGF-1 (10 нг/мл), клетки открепляли от пластика раствором трипсин (0,25% трипсина с солями Хенкса, ПанЭко, Россия) и промывали фосфатно-солевым раствором DPBS из расчета 1 106. Далее готовили клеточные лизаты в буфере RIPA (кат. № G2002-30ML, Servicebio, Китай) для определения относительного количества маркеров EndMT методом Вестерн блот. Для измерения концентрации белка в лизате клеток использовали метод Бредфорда [19]. Для измерения концентрации белка в лизате клеток использовали метод Бредфорда [19]. 20 мкг белков клеточного лизата смешивали с буфером Laemli (BioRad, США), содержащим 2-меркаптоэтанол, в соотношении 1:2, далее фракционировали с помощью 10% полиакриламидных гелей SDS и переносили на нитроцеллюлозную мембрану, проводили блокировку (Servicebio, Китай). После инкубации с первичными антителами при 4 C в течение ночи мембраны затем инкубировали со вторичными антителами в течение 60 мин. Блоты визуализировали и анализировали с использованием системы ChemiDocXRS+ (Вио-Рад) и нормализовали по GAPDH.</p> <p>Далее в лизатах клеток определяли относительное количество белков, характеризующих EndMT: эндотелиальных маркеров EndMT c использованием первичных кроличьих моноклональных антител CD31 (кат. № AF6191, Affinity Biosciences, Китай) и von Willebrand factor, vWF (кат. № AF3000, Affinity Biosciences, Китай); мезенхимальных маркеров - c использованием первичных кроличьих моноклональных антител Fibronectin (кат. № AF5335, Affinity Biosciences, Китай) и Vimentin (кат. № AF0292, Affinity Biosciences, Китай), GAPDH (кат. № AF5161, Affinity Biosciences, Китай). Первичные антитела визуализировали при помощи вторичных козлиных антител (Goat anti-Rabbit IgG (H+L) кат. № S0013, Affinity Biosciences, Китай). Количество маркеров EndMT определяли относительно содержания белка домашнего хозяйства GAPDH.</p> <p>Статистическая обработка результатов. Полученные результаты анализировали при помощи программы ГрафПад Призм 8. Полученные результаты оценивали тестом ANOVA.</p> <p>Для оценки статистической значимости различий в сравнении с контролем применяли тест Даннета. Статистически значимыми считались различия при p0,05. Описанные выше эксперименты были повторены трижды.</p> <p><strong><em>Полученные результаты и их обсуждение.</em></strong> В ходе исследования было выявлено, что воздействие TGF-1 (10 нг/мл) в течение 3 суток на клеточную культуру HUVEC достоверно снижало относительное количество CD31 на 45,4% и vWF на 34,3% относительно контроля, что говорит о потере эндотелиальными клетками своих характерных маркеров (р0,05), что представлено на рис. 1.</p> <p><strong><em>Рис.1. Относительное количество маркеров эндотелиального профиля CD 31 и vWF<br />в клеточной культуре HUVEC при воздействии TGF-1 в концентрации 10 нг/мл <br />в течение 72 ч (М SD, n = 3); </em></strong><em>А) Влияние TGF-1 на клеточную культуру HUVEC в течение 72 ч вызывало достоверное снижение относительного количества CD 31 на 45,4% относительно контроля; Б) Влияние TGF-1 на клеточную культуру HUVEC в течение 72 ч вызывало достоверное снижение относительного количества vWF на 34,3% относительно контроля; примеч. ** р 0,005; *** р =0,0005</em></p> <p></p> <p>Одновременно, воздействие TGF-1 на первичную культуру HUVEC в течение 72 ч достоверно повышало относительное количество Fibronectin на 43,3% и Vimentin на 50,7% относительно контроля (р0,05), что свидетельствует о приобретении эндотелиальными клетками мезенхимальных характеристик, что представлено на рис. 2.</p> <p><strong><em>Рис.2. Относительное количество маркеров мезенхимального профиля в клеточной культуре HUVEC при воздействии TGF-1 в концентрации 10 нг/мл в течение 72 ч (М SD, n = 3) А Fibronectin; Б Vimentin; </em></strong><em>А) Влияние TGF-1 на клеточную культуру HUVEC в течение 72 ч вызывало достоверное повышение относительного количества Fibronectin на 43,3% относительно контроля; Б) Влияние TGF-1 на клеточную культуру HUVEC в течение 72 ч вызывало достоверное повышение относительного количества Vimentin на 50.7% относительно контроля; примеч. ** р 0,005; *** р =0,0001</em></p> <p></p> <p>Полученные данные сопоставимы с результатами других методик моделирования EndMT. Wang Z. et al. моделировали EndMT следующим образом: клетки HUVEC подвергали сывороточному голоданию в течение ночи, а затем обрабатывали 0, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 нг/мл TGF-1 в течение 48 часов или обрабатывали 5 нг/мл TGF-1 в течение 0, 1, 6, 12, 24, 48 и 72 часов. В результатах сообщалось, что TGF-1 повышал экспрессию белка и мРНК -SMA и коллагена I и подавлял экспрессию белков и мРНК VE-кадгерина и CD31, этот эффект достигал пика через 72 часа [12].</p> <p>EndMT является важным участником эмбрионального развития, однако, в постнатальном периоде вносит весомый вклад в развитие патологий сердечно-сосудистой системы. Поэтому изучение данного процесса вызывает высокий научный интерес и обусловливает поиск экспериментальных моделей для его исследования. Моделирование EndMT in vitro является перспективной способом для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе развития этого явления, что позволяет избежать этических сложностей связанных с проведением экспериментов на животных, а также высоких экономических трат на масштабные клинические исследования.</p> <p><strong><em>Выводы.</em></strong> Воздействие человеческого рекомбинантного TGF-1 в концентрации 10 нг/мл в течение 3 суток на первичную культуру HUVEC позволяет достоверно индуцировать EndMT in vitro, что подтверждается статистически значимым снижением относительного количества эндотелиальных маркеров EndMT CD31 и vWF и повышением относительного количества мезенхимальных маркеров Fibronectin и Vimentin в лизатах культур клеток.</p>1.1. Markwald R. R., Fitzharris T. P., Manasek F. J. Structural development of endocardial cushions //American Journal of Anatomy. – 1977. – Т. 148. – №. 1. – С. 85-119.2.2. Alvandi Z., Bischoff J. Endothelial-mesenchymal transition in cardiovascular disease //Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. – 2021. – Т. 41. – №. 9. – С. 2357-2369.3.3. Калинин Р. Е. и др. Фактор фон виллебранда при выполнении инвазивных вмешательств у больных с периферическим атеросклерозом //Российский медико-биологический вестник имени академика ИП Павлова. – 2021. – Т. 29. – №. 3. – С. 389-396.4.4. Nan W. et al. Molecular mechanism of VE-cadherin in regulating endothelial cell behaviour during angiogenesis //Frontiers in physiology. – 2023. – Т. 14. – С. 1234104.5.5. Wu Q. et al. PECAM-1 drives β-catenin-mediated EndMT via internalization in colon cancer with diabetes mellitus //Cell Communication and Signaling. – 2023. – Т. 21. – №. 1. – С. 203.6.6. Ding H. et al. TGF-β-induced α-SMA expression is mediated by C/EBPβ acetylation in human alveolar epithelial cells //Molecular medicine. – 2021. – Т. 27. – С. 1-12.7.7. Ridge K. M. et al. Roles of vimentin in health and disease //Genes & development. – 2022. – Т. 36. – №. 7-8. – С. 391-407.8.8. Patten J., Wang K. Fibronectin in development and wound healing //Advanced drug delivery reviews. – 2021. – Т. 170. – С. 353-368.9.9. Piera-Velazquez S., Jimenez S. A. Endothelial to mesenchymal transition: role in physiology and in the pathogenesis of human diseases //Physiological reviews. – 2019. – Т. 99. – №. 2. – С. 1281-1324.10.10. Ma J. et al. TGF-β-induced endothelial to mesenchymal transition is determined by a balance between SNAIL and ID factors //Frontiers in Cell and Developmental Biology. – 2021. – Т. 9. – С. 616610.11.11. Ursoli Ferreira F. et al. Endothelial cells tissue-specific origins affects their responsiveness to TGF-β2 during endothelial-to-mesenchymal transition //International journal of molecular sciences. – 2019. – Т. 20. – №. 3. – С. 458.12.12. Wang Z. et al. Role of endothelial‐to‐mesenchymal transition induced by TGF‐β1 in transplant kidney interstitial fibrosis //Journal of cellular and molecular medicine. 2017. – Т.21, №. 10. – С. 2359-2369.13.13. Tzavlaki K., Moustakas A. TGF-β Signaling //Biomolecules. – 2020. – Т. 10. – №. 3. – С. 487.14.14. Alvandi Z., Bischoff J. Endothelial-mesenchymal transition in cardiovascular disease //Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. – 2021. – Т. 41. – №. 9. – С. 2357-2369.15.15. Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M. & Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Res 67, 10123–10128.16.16. Frangogiannis N. G. Transforming growth factor-β in myocardial disease //Nature Reviews Cardiology. – 2022. – Т. 19. – №. 7. – С. 435-455..17.17. Crampton S.P., Davis J., Hughes C.C. // J Vis Exp. 2007. Vol. 3. P.183.18.18. Мжаванадзе Н. Д. и др. Эндотелий in vivo и in vitro. Часть 2: особенности и перспективы лабораторной работы с эндотелиоцитами //Наука молодых–Eruditio Juvenium. – 2020. – Т. 8. – №. 3. – С. 407-421.19.19. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding //Analytical biochemistry. – 1976. – Т. 72. – №. 1-2. – С. 248-254.