Прикладные информационные аспекты медицины

2070-9277

Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko - The State Budgetary Institution of Higher Professional Education «Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko» of the Ministry of Public Health of the Russian

10750

10.18499/2070-9277-2025-28-1-76-82

Effect of sex hormones on the expression of ABC transporters glycoprotein-P and breast cancer resistance protein in vitro

Slepnev

Alexander Aleksandrovich

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Department of Pharmacologya.slepnev@rzgmu.ruAbalenikhina

Julia

Doctor of Medical Sciences, Associate Professor, Professor of the Department of Biological Chemistry, Leading Researcher at the Central Research Instituteabalenihina88@mail.ruSchulkin

Alexey Vladimirovich

Doctor of Medicine, Associate Professor, Professor of the Department of Pharmacologyalekseyshulkin@rambler.ruAnanyeva

Pelageya Dmitrievna

Assistant Professor of the Department of Pharmacology, Junior Researcher at the Central Research Instituteerokhina.pelageya96@yandex.ruPravkin

Sergei Konstantinovich

PhD, Associate Professor, Associate Professor of the Department of Pharmacologypsco@mail.ruYakusheva

Elena Nikolaevna

MD, Professor, Head of the Department of Pharmacologye.yakusheva@rzgmu.ru

Pavlov Ryazan State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

30032025

2817682

21032025

2025

P-glycoprotein (Pgp, ABCB1 protein, MDR1 protein) and breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2) are the most studied of the ABC transporter superfamily. Proteins of this superfamily provide the transport of substrates through the bilipid membrane of cells due to the energy of ATP. In this study, we studied the effect of sex hormones on the expression of the MDR1 encoding Pgp and ABCG2 encoding BCRP genes on Caco-2 cells in vitro. Estradiol, progesterone, and testosterone were added to the cells at concentrations of 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 М, 10 М, and 100 М and incubated for 24 hours. After the incubation was completed, the total RNA was isolated and the expression of the MDR1 and ABCG2 was evaluated by real-time polymerase chain reaction. During the study, it was found that estradiol increases the expression of the MDR1 gene at concentrations of 1-100 М, increases the expression of the ABCG2 gene at concentrations of 100 nM, 1, 10 and 100 М in Caco-2 cells. Progesterone increases the expression of the MDR1 and ABCG2 genes at concentrations of 10-100 М. Testosterone at concentrations of 10 and 100 М reduces the mRNA level of the MDR1 gene and increases the expression of the ABCG2 gene in the concentration range of 1-100 М.

glycoprotein-P, breast cancer resistance protein, estradiol, progesterone, testosterone, MDR1, ABCG2

Р-гликопротеин, белок резистентности рака молочной железы, эстрадиол, прогестерон, тестостерон, MDR1, ABCG2

Актуальность. P-гликопротеин (Pgp, ABCB1-белок, MDR1-белок) и белок резистентности рака молочной железы (BCRP, ABCG2) являются самыми изученными представителями суперсемейства ABC-транспортеров. Белки этого суперсемейства обеспечивают транспорт субстратов через мембрану клеток за счет энергии АТФ [1]. Pgp и BCRP являются эффлюксными транспортерами, то есть способствуют выведению веществ из клеток во внеклеточное пространство и биологические жидкости. Данные транспортеры локализуются в клетках кишечника, печени, почечных канальцев, эндотелиальных клетках гистогематических барьеров, где выполняют защитную функцию, препятствуя всасыванию субстратов в системный кровоток из желудочно-кишечного тракта, выводя их в желчь и мочу или ограничивая проникновение в забарьерные органы через гистогематические барьеры [2, 3]. Pgp и BCRP обладают широкой субстратной специфичностью. Субстратами Pgp являются противоопухолевые, гипотензивные и антигистаминные препараты, сердечные гликозиды, антиагреганты, антикоагулянты, стероидные и тиреоидные гормоны, антибиотики, ингибиторы ВИЧ-протеиназы, иммунодепрессанты и др. [4, 5]. К субстратам BCRP относят противоопухолевые средства (метотрексат, митоксантрон), празозин, глибурид, циметидин, сульфасалазин, нитрофурантоин, розувастатин и др. Функционирование данных белков-транспортеров может изменяться под влиянием различных веществ: индукторы повышают их активность, а ингибиторы ее снижают [5]. Влияние половых гормонов на активность и количество белков-транспортеров в органах и тканях, которые не являются для них основными мишенями, например, в кишечнике, малоизучено. Ранее нами было показано, что эстрадиол и прогестерон повышают [6, 7], а тестостерон снижает количество Pgp [8], все указанные половые гормоны повышают уровень BCRP [9] в клетках линии Caco-2. Однако, механизмы установленного воздействия на данный момент не оценивались. Поэтому в рамках настоящего исследования изучалось влияние половых гормонов на экспрессию гена MDR1, кодирующего Pgp, и гена ABCG2, кодирующего BCRP в клетках линии Caco-2. Материал и методы исследования. Исследование выполнено на линии клеток Caco-2 (клетки аденокарциномы ободочной кишки человека, англ.: сancer coli, colon cancer), которые были получены из ФГБУН ИНЦ РАН (Санкт-Петербург). Клетки культивировали при 37С и 5% содержании СО2 в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л) (Sigma-Aldrich, Германия), содержащей L-глутамин (4 мМ) (Sigma-Aldrich, Германия), 15% эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma- Aldrich, Германия), 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина (Sigma-Aldrich, Германия) соответственно. После достижения 70-90% конфлюентности клетки снимали с фласка добавлением раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, Sigma-Aldrich, Германия) и высеивали в 6-луночные планшеты (Corning, США). Клетки культивировали в течение 21 сут, поскольку при данном сроке происходит их спонтанная дифференцировка в энтероцитоподобные клетки, гиперэкспрессирующие Pgp и BCRP [10]. Эстрадиол, прогестерон и тестостерон добавляли к клеткам в концентрациях 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ и инкубировали в течение 24 ч. К контрольным клеткам добавляли спирт этиловый (растворитель гормонов) в эквивалентном количестве. На каждый эксперимент было выполнено по 3 повторения (n=3). После воздействия тестируемых веществ клетки механически снимали с лунок скребком, трижды промывали в фосфатно-солевом буфере и центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин. Суммарную РНК выделяли с использованием набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию РНК в образцах определяли спектрофотометрически с помощью прибора NanoPhotometr NP80-Touch (Implen GmbH, Германия). Экспрессию генов MDR1, ABCG2 оценивали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Для проведения ПЦР на первом этапе РНК в количестве 1 мкг подвергали обратной транскрипции c использованием набора реактивов БиоМастер ОТ-ПЦР SYBR Blue (2) для проведения ОТ-ПЦР в реальном времени с SYBR Green I (Биолабмикс, Россия). Обратная транскрипция проводилась при температуре 45С, время инкубации составило 10 минут, количество циклов 1. Этот этап необходим для синтеза цепей кДНК. На втором этапе с синтезированной кДНК проводили ПЦР в реальном времени. В качестве референсного, относительно которого вычислялась экспрессия генов, был выбран ген, кодирующий глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH). Последовательности прямого и обратного праймеров представлены в таблице 1. Таблица 1 Праймеры, использованные в работе (Beagle, Россия) <table> <tbody> <tr> <td colspan="2" width="623"> Для MDR1 </td> </tr> <tr> <td width="179"> Прямой праймер </td> <td width="444"> 5'-CTTCTTTGCTCCTCCATTGC-3' </td> </tr> <tr> <td width="179"> Обратный праймер </td> <td width="444"> 5'-CCGCTGTTCGTTTCCTTTAG-3' </td> </tr> <tr> <td colspan="2" width="623"> Для ABCG2 </td> </tr> <tr> <td width="179"> Прямой праймер </td> <td width="444"> 5'-CTGTCTACTCTTTGCTCAGCTTC-3' </td> </tr> <tr> <td width="179"> Обратный праймер </td> <td width="444"> 5'-GCTCAGTTAACTCCTGTAAGTGC-3' </td> </tr> <tr> <td colspan="2" width="623"> Для GAPDH </td> </tr> <tr> <td width="179"> Прямой праймер </td> <td width="444"> 5'-GTCCCTCTGACTTCAACAGCG-3' </td> </tr> <tr> <td width="179"> Обратный праймер </td> <td width="444"> 5' ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3' </td> </tr> </tbody> </table> Исследование проводили по нижеприведенным условиям температурных циклов: денатурация (нагрев реакционной смеси) при 95С, охлаждение при 53С, элонгация при 72С. Дальнейший анализ осуществляли на амплификаторе нуклеиновых кислот Applied Biosystems Quant Studio 5 с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени (Life Technologies Holdings Pte. Ltd., Сингапур) с программным обеспечением QuantStudio Design and Analysis (Thermo Fisher Scientific, США). Уровень экспрессии SLCO1B1 и ABCG2 оценивали относительно референсного гена. Полученные результаты анализировали с помощью программ GraphPad Prism8. Статистическую значимость различий оценивали дисперсионном анализом (ANOVA), парные сравнения c контролем выполняли с помощью теста Тьюки. Результаты на графиках приведены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения (МSD). Статистически значимыми считали различия при p0,05. Полученные результаты и их обсуждение. При экспозиции 24 ч эстрадиол в концентрации 1 мкМ вызывал повышение экспрессии гена MDR1 на 78,9% (p=0,047), в концентрации 10 мкМ на 94,2% (p=0,016), в концентрации 100 мкМ на 101,5% (p=0,0096) по сравнению с контролем. Прогестерон в концентрации 10 мкМ повышал экспрессию MDR1 на 65,1% (p=0,04), в концентрации 100 мкМ на 81,8% (p=0,009) по сравнению с контролем. В отличие от женских половых гормонов, тестостерон в концентрациях 10 и 100 мкМ вызывал снижение уровня мРНК MDR1 на 43,4% (p=0,039) и на 45,3% (p=0,03) соответственно (рис. 1). Рис. 1. Относительная экспрессия мРНК MDR1 в клетках линии Caco-2 при воздействии эстрадиола, прогестерона, тестостерона, среднееSD (n=3 в каждой серии) Клетки Caco-2 экспрессируют эстрогеновые рецепторы тип [11] и андрогеновые рецепторы [12], поэтому можно предположить, что эффекты эстрогена и тестостерона на биосинтетические процессы реализуются через эти рецепторы. Поиск в области промотора гена MDR1 человека участка связывания с эстрогеновыми рецепторами с использованием базы данных TRANSFAC выявил присутствие предполагаемого estrogen response element выше сайта инициации транскрипции [13]. В то же время <a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Arias%20A%5BAuthor%5Dcauthor=truecauthor_uid=24685904">Arias A</a>. (2014) при проведении подобного анализа с применением базы данных TFSEARCH в промоторе гена MDR1 не выявил estrogen response element. Однако в данном исследовании были обнаружены сайты связывания для транскрипционного фактора AP-1, что предполагает опосредованное влияние эстрадиола на экспрессию Pgp [14]. На клетках рака молочной железы MCF-7/PTX было показано, что ER активирует транскрипцию MDR1, связываясь с атипичным estrogen response element (halfERE)-(N)x-(GC rich), состоящим из 1/2 estrogen response element и двух сайтов связывания Sp1 и располагающимся перед CG-богатым элементом в промоторе MDR1. Нокдаун гена MDR1 сдерживал действие ER в клетках MCF-7 и повышал чувствительность клеток к паклитакселу [15, 16]. Воздействие эстрадиола в концентрациях 100 нМ, 1, 10 и 100 мкМ в течение 24 ч увеличивало экспрессию гена ABCG2, кодирующего BCRP, в клетках линии Caco-2 на 56,8% (p=0,0012), на 54,4% (p=0,0018), на 67,0% (p=0,0003) и на 53,2% (p=0,0021) соответственно по сравнению с контролем. Инкубирование клеток линии Caco-2 с прогестероном приводило к повышению мРНК гена ABCG2 в концентрации гормона 10 мкМ на 76,3% (p=0,011), в концентрации 100 мкМ на 107,4% (p=0,0007). Тестостерон в концентрации 1 мкМ повышал экспрессию гена ABCG2 на 76,7% (p=0,034), в концентрации 10 мкМ на 86,4% (p=0,016), в концентрации 100 мкМ на 90,8% (p=0,011) (рис. 2). Рис. 2. Относительная экспрессия мРНК ABCG2 в клетках линии Caco-2 при воздействии эстрадиола, прогестерона, тестостерона, среднееSD (n=3 в каждой серии) Обработка эстрадиолом клеток MCF-7, трансфицированных плазмидой, содержащей ген BCRP, повышала экспрессию мРНК и белка BCRP. Тамоксифен, антиэстрогенное соединение, подавлял повышенную регуляцию, вызванную эстрадиолом. Анализы сдвига электрофоретической подвижности, проведенные с ядерными экстрактами клеток MCF-7, которые являются ER-положительными, параллельно с ядерными экстрактами MDA-MB-231 ER-отрицательных клеток, выявили сдвиг полосы, возникающий в результате связывания ER с зондом, содержащим промотор гена ABCG2, не наблюдаемый в клетках MDA-MB-231 [17]. Показано, что прогестероновый рецептор взаимодействует с промотором гена ABCG2 путем взаимодействия с фактором транскрипции Sp1. Обработка клеток BeWo прогестероном увеличила экспрессию белка BCRP [18]. Это предполагает передачу сигнала через мембранный прогестероновый рецептор и подчеркивает гипотезу о тканезависимой регуляции BCRP прогестероном. Выводы. Таким образом, эстрадиол в клетках линии Сасо-2 при длительности воздействия 24 ч повышает экспрессию гена MDR1, кодирующего Pgp, в концентрациях 1-100 мкМ и увеличивает экспрессию гена ABCG2, кодирующего BCRP, в концентрациях 100 нМ, 1, 10 и 100 мкМ. Прогестерон в клетках линии Сасо-2 при длительности воздействия 24 ч повышает экспрессию генов MDR1 и ABCG2 в концентрациях 10-100 мкМ. Тестостерон в аналогичных условиях эксперимента в концентрациях 10 и 100 мкМ снижает уровень мРНК гена MDR1, но повышает экспрессию гена ABCG2 в диапазоне концентраций 1-100 мкМ.

1. Robey R.W., Pluchino K.M., Hall M.D., et al. Revisiting the role of ABC transporters in multidrug-resistant cancer // Nat. Rev. Cancer. – 2018. - 18:452-464. doi:10.1038/s41568-018-0005-8

2. Borst P. P-glycoprotein ABCB1: a major player in drug handling by mammals // J. Clin. Invest. – 2013. – 123(10): 4131–4133. doi: 10.1172/JCI70430

3. Maliepaard M., Scheffer G.L., Faneyte I.F., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues // Cancer Res. - 2001. – 61 (8): 3458–3464

4. Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., Гацанога М.В. Методика определения принадлежности лекарственных средств к числу субстратов гликопротеина-Р // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. – 2015. – 23(3): 49-53.

5. Liu X., Pan G. Drug Transporters in Drug Disposition, Effects and Toxicity // Advances in Experimental Medicine and Biology. 2019. – 1141:588р. doi:10.1007/978-981-13-7647-4

6. Ерохина П.Д., Абаленихина Ю.В., Щулькин А.В., др. Изучение влияния прогестерона на активность гликопротеина-Р in vitro // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. – 2020. – 28(2): 135-142. doi: 10.23888/PAVLOVJ2020282135-142

7. Ерохина П.Д., Абаленихина Ю.В., Щулькин А.В., др. Изучение влияния эстрадиола на активность гликопротеина-Р in vitro // Наука молодых (eruditio juvenium). – 2020. – 8 (3):329-336. doi:10.23888/HMJ202083329-336

8. Слепнев А.А., Щулькин А.В., Абаленихина Ю.В., др. Механизм влияния тестостерона на белок-транспортер Р-гликопротеин // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. – 2022. 108(9):1188-1199

9. Слепнев А.А., Абаленихина Ю.В., Попова Н.М. и др. Влияние половых гормонов на белок транспортер abcg2 в клетках линии Сaco-2 // Биологические мембраны. 2023. – 40 (5):370-378. doi:10.31857/S0233475523050109

10.

10. Hilgers A.R., Conradi R.A., Burton P.S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa // Parm Res. – 1990. – 7(9): 902-910. doi: 10.1023/a:1015937605100

11.

11. Campbell-Thompson M., Lynch I.J., Bhardwaj B. Expression of estrogen receptor (ER) subtypes and ERbeta isoforms in colon cancer // Cancer Res. – 2001. – 61(9):632–640.

12.

12. Gu S., Papadopoulou N., Gehring E.M., et al2009. Functional membrane androgen receptors in colon tumors trigger pro-apoptotic responses in vitro and reduce drastically tumor incidence in vivo. Mol Cancer. 8, 114. doi:10.1186/1476-4598-8-114

13.

13. Coles L.D., Lee I.J., Voulalas P.J., Eddington N.D. Estradiol and progesterone-mediated regulation of P-gp in P-gp overexpressing cells (NCI-ADR-RES) and placental cells (JAR) // Mol. Pharm. – 2009. – 6(6): 1816-1825. doi: 10.1021/mp900077q.

14.

14. Arias A., Rigalli J.P., Villanueva S.S. et al. Regulation of expression and activity of multidrug resistance proteins MRP2 and MDR1 by estrogenic compounds in Caco-2 cells. Role in prevention of xenobiotic-induced cytotoxicity // Toxicol. – 2014. – 320: 46-55. doi: 10.1016/j.tox.2014.03.007

15.

15. Chen S., Wang H., Li Z. et al. Interaction of WBP2 with ERα increases doxorubicin resistance of breast cancer cells by modulating MDR1 transcription // British J. Cancer. – 2018. – 119:182–192. doi: 10.1038/s41416-018-0119-5

16.

16. Shi J.F., Yang N., Ding H.J. et al. ERα directly activated the MDR1 transcription to increase paclitaxel-resistance of ERα-positive breast cancer cells in vitro and in vivo // Int. Biochem. Cell Biol. – 2014. – 53: 35-45. doi: 10.1016/j.biocel.2014.04.016

17.

17. Zhang Y., Zhou G., Wang H., et al. Transcriptional upregulation of breast cancer resistance protein by 17beta-estradiol in ERalpha-positive MCF-7 breast cancer cells // Oncology. 2007. - 71:446–455. doi:10.1159/ 000108594

18.

18. Wang H., Zhou L., Gupta A., Vethanayagam R.R., et al. Regulation of BCRP/ABCG2 expression by progesterone and 17beta-estradiol in human placental BeWo cells // Am J Physiol. Endocrinol. Metab. 2006. - 290:E798-807. doi:10.1152/ajpendo.00397.2005