THE EFFECT OF HIGH SUCCINATE CONCENTRATION ON MYOGENESIS OF THE C2C12 CELL LINE IN VITRO

Maria Isaeva; Исаева Мария Олеговна; Julia Abalenikhina; Абаленихина Юлия Владимировна; Fidan Gadzhieva; Гаджиева Фидан Тофиковна; Alexey Shchulkin; Щулькин Алексей Владимирович; Elena Yakusheva; Якушева Елена Николаевна

doi:10.18499/2070-9277-2024-27-1-%p

THE EFFECT OF HIGH SUCCINATE CONCENTRATION ON MYOGENESIS OF THE C2C12 CELL LINE IN VITRO

Authors: Isaeva M.¹, Abalenikhina J.¹, Gadzhieva F.¹, Shchulkin A.¹, Yakusheva E.¹
Affiliations:
1. ФГБОУ ВО РязГМУ им. академика И.П. Павлова Минздрава России
Issue: Vol 27, No 1 (2024): Опубликован 29.03.2024
Pages: 92-99
Section: Articles
URL: https://new.vestnik-surgery.com/index.php/2070-9277/article/view/9930
DOI: https://doi.org/10.18499/2070-9277-2024-27-1-%25p

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Statistics

Abstract

Myogenesis is a complex process that involves many stages, starting from the formation of precursor cells of muscle tissue and ending with the formation of mature muscle fibers. Succinate is an intermediate product of metabolism and metabolites of the tricarboxylic acid cycle (Krebs cycle). During myogenesis, it participates in the synthesis of mitochondrial proteins that provide cells with energy and is a donor of protons and electrons for the II complex of the respiratory chain (succinate dehydrogenase). The aim of the study is to study the effect of succinate at a concentration of 1 mM on the differentiation of the C2C12 cell line. Microscopic (assessment of cell length, width and myogenesis index) and Western blot methods (assessment of the transcription factor regulating the initial stages of differentiation - MyoD) were used for the study. The experiment showed that succinate at a concentration of 1 mM stimulates accelerated differentiation of myoblasts, increasing MyoD levels and stimulating the formation of myotubes in the first days of differentiation. Thus, succinate at a concentration of 1 mM can be considered as a promising drug for rapid stimulation of muscle tissue regeneration for athletes after heavy muscle loads and for astronauts during adaptation after a long stay in zero gravity.

Keywords

C2C12 cell line, myogenesis, cell fusion index, succinate.

Full Text

Актуальность. Сукцинат (янтарная кислота) – это органическое соединение, которое играет важную роль во многих процессах, происходящих в организме человека. Янтарная кислота является промежуточным продуктом обмена веществ и участвует в цикле трикарбоновых кислот (цикл Кребса). Она обладает рядом полезных свойств, которые делают ее привлекательной для использования в различных областях медицины, например, антиоксидантными свойствами, которые помогают защитить клетки от повреждения свободными радикалами.

Миогенез - это сложный процесс, который включает в себя множество стадий, начиная от формирования клеток-предшественников мышечной ткани и заканчивая формированием зрелых мышечных волокон [1]. В ходе миогенеза сукцинат может выполнять ряд функций, которые необходимы для нормального функционирования мышц, например, участвует в синтезе митохондриальных белков, которые обеспечивают клетки энергией и является донором протонов и электронов для II комплекса дыхательной цепи (сукцинатдегидрогеназы). Митохондрии - это энергетические станции клеток, и их количество и активность напрямую связаны с уровнем янтарной кислоты [2]. Ранее мы исследовали положительное действие сукцината в концентрации 10 мкМ на миогенез клеточной линии С2С12, поэтому предполагаем, что он участвует в процессах регенерации скелетных мышц [3].

Изучение воздействия на миогенез различных внешних и внутренних факторов имеет огромное значение для понимания и развития человеческого тела и его функций. Мышцы играют ключевую роль в движении, поддержании осанки и участвуют в большинстве физиологических процессов. Понимание механизмов миогенеза может привести к разработке новых методов лечения и профилактики различных мышечных заболеваний.

Цель исследования: изучение влияния сукцината в концентрации 1 мМ на дифференцировку клеточной линии С2С12.

Материал и методы исследования. Работа выполнена на клеточной линии С2С12 (Институт биологии гена, г. Москва). Культивирование клеток проводилось в стандартных условиях: 37ºС и 5% содержании СО2 (инкубатор WS-189C (World Science, Корея)). Клетки растили в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с содержанием глюкозы 4500 мг/л, L-глутамина 4 мМ, 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (все компоненты производства Sigma-Aldrich, Германия). Клетки растили на фласке, после достижения 70−90% конфлюентности их пересеивали, предварительно снимали с подложки раствором трипсин-ЭДТА (Sigma-Aldrich, Германия), далее высевали в 6- луночные планшеты (Сorning, США).

В качестве группы сравнения использовали клетки до дифференцировки, которые культивировали 4 дня в питательной среде DMEM. После образования монослоя, в питательной среде 10% эмбриональную бычью сыворотку заменяли на 2% лошадиную сыворотку [4], что представляло собой экспериментальную группу клетки на этапе 1 и 4 дней дифференцировки. К данной группе клеток в питательную среду вносили сукцинат в концентрации 1 мМ. На каждый эксперимент было выполнено по 3 повторения.

Фото клеток получены с помощью инвертированного микроскопа Олимпус CKX-53 с цифровой цветной камерой, разрешение 5 МПикс, оценка их размеров выполнена с использованием графических редакторов персональном компьютере.

На каждом этапе дифференцировки оценивали индекс миогенеза (индекс клеточного слияния, IM). Для этого клетки фиксировали 95% этанолом (5 мин), затем прокрашивали ядра миобластов раствором Романовского-Гимзе и выдерживали при комнатной температуре 20-25 минут. После удаления красителя, клетки промывали фосфатным буфером (ПанЭко, Россия) и микроскопировали.

Для количественного анализ процесса миогенной дифференцировки рассчитывали индекс миогенеза (IM) – долю ядер, находящихся в миотрубках, содержащих два или более ядра по отношению к общему количеству ядер. Для анализа выбирали пять полей зрения на 6-луночном планшете площадью 9,6 см2 (n=3) при увеличении 200 и общее количество проанализированных ядер составляло 90-120 на поле. Индекс миогенеза рассчитывали по формуле:

где IM – индекс миогенеза, А – количество ядер в многоядерных клеточных структурах, В – количество многоядерных клеточных структур, С – количество ядер в поле зрения [5;6].

Относительное количество транскрипционного фактора оценивали методом вестерн-блот. Первоначально готовили клеточные лизаты с использованием клеточного буфер для лизиса NP40 Thermo из расчета 107 клеток на 100 мкл буфера. Полученный лизат центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 минут. Для анализа использовали супернатант, который представлял собой цитоплазматическую фракцию белков.

Далее клеточный лизат использовали для проведения метода вестер-блот по стандартному протоколу [4].

Для детекции MyoD использовали первичные мышиные моноклональные антитела sc-377460 MyoD (G-1) в концентрации 1:200 и вторичные кроличьи антитела Mouse IgG (H+L) в разведении 1:4000.

Белки визуализировали хемилюминесценцией. Интенсивность полученных полос (бэндов) анализировали денситометрически с помощью специального программного обеспечения.

Относительное количество MyoD пересчитывали на содержание глицеральдегид-3-фосфата GAPDH, разведение 1:1000, вторичные антитела - вторичные кроличьи антитела к первичным антителам GAPDH - Rabbitanti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, разведение 1:4000.

Цитотоксическое действие сукцината оценивали по результатам МТТ-теста. Клетки культивировали в 96-луночном планшете, затем добавляли питательную среду с сукцинатом, инкубировали 1 час [7]. Оптическую плотность измеряли через при λ=530 нм на спектрофотометре для микропланшетов. Жизнеспособность клеток С2С12 в присутствии сукцината рассчитывали по формуле:

где ОП – оптическая плотность.

Полученные результаты анализировали с помощью стандартного программногообеспечения. Статистическую значимость различий оценивали дисперсионным анализом (ANOVA), парные сравнения с контролем выполняли с помощью теста Даннетта. Результаты представлены в виде М±SD. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Полученные результаты и их обсуждение. На начальном этапе исследования оценивали цитотоксичность сукцината в концентрации 1 мМ. В ходе работы было выявлено, что жизнеспособность клеток при добавлении сукцината в питательную среду не изменяется по сравнению с контролем, принятым за 100% и составляет 84,24±13,8%.

Миобласты до дифференцировки представляют собой одноядерные клетки со средней длиной 71,65 мкм и шириной - 26,42 мкм, имеющие звездчатую или веретенообразную форму. В недифференцированных клетках отсутствуют многоядерные структуры, среднее количество ядер составляет 75 в одном поле зрения. Замена питательной среды на дифференцировочную стимулирует переход миобластов

на программу дифференцировки: постепенное удлинение миобластов и формирование многоядерных структур – миотрубочек (рис. 1).

Индекс миогенеза в клетках до дифференцировки был равен 0. Активация миогенеза приводила к увеличению индекса слияния клеток, в 1 сутки он составил 15,4±5,2% (р=0,02). Визуально происходило образование двуядерных структур и удлинение клеток. Размер клеток в длину увеличивался на 70,99% (р>0,05), а в ширину уменьшался на 41,90% (р>0,05) относительно клеток до дифференцировки. Количество многоядерных структур на первые сутки дифференцировки было равно 6 в одном поле зрения, а общее количество ядер – 39 в одном поле зрения.

На 4 день дифференцировки наблюдали продолжение увеличения индекса миогенеза на 193% (p=0,0007) относительно 1 дня дифференцировки. На среднем этапе дифференцировки возрастало количество двуядерных и появлялись редкие клетки, содержащие три ядра и более, что свидетельствовало об интенсивном слиянии миобластов. Среднее количество многоядерных структур на 4 сутки – 10 в поле зрения, а общее количество ядер – 59 в одном поле зрения. Длина клеток увеличивалась на 4,56% (р>0,05), а ширина на 4,30% (р>0,05) относительно клеток 1 дня дифференцировки.

При добавлении в дифференцировочную среду сукцината в концентрации 1 мМ в течении суток дифференцировки наблюдается увеличение индекса клеточного слияния на 446,7% относительно группы дня дифференцировки (p<0,0001). Стимуляция миогенеза сукцинатом вызывает активную дифференцировку миобластов и увеличение многоядерных структур с количеством ядер более двух. Среднее количество многоядерных структур в день - 163 в поле зрения, а общее количество ядер – 173 в одном поле зрения. Размер многоядерных структур увеличивался в длину на 27,62% (p=0,0054) относительно клеток, инкубируемых день в дифференцировочной питательной среде, и по сравнению с клетками до дифференцировки увеличивался размер клеток на 222,41% (p<0,0001) в длину. При добавлении сукцината 1 мМ в течении 1 дня размер клеток в ширину достоверно не изменялся относительно миобластов до дифференцировки и в 1 день дифферецировки. Добавление сукцината в концентрации 1 мМ в течении 4 дней приводило к возрастанию индекса миогенеза на 70,5% (p<0,0001) относительно клеток культивируемых 4 дня на дифференцировочной питательной среде. Визуально происходило образование большого количества вытянутых многоядерных структур. Размер клеток в длину увеличивался на 94,74% (p<0,0001) относительно клеток 4 дня дифференцировки. По сравнению с добавлением сукцината в течении 24 ч размер клеток увеличивается в длину на 56,55% (p=0,0068). В ширину размер клеток при добавлении сукцината 1 мМ в течении 4 дней достоверно не изменялся относительно клеток 1 и 4 дня дифференцировки. Количество многоядерных структур на первые сутки дифференцировки было равно 117 в одном поле зрения, а общее количество1724, 2194, 2683, 2892, 3688, 3827, 4414, 5180, 5289, 5394, 5693, 6201, 6268, 6427, 6599, 7048, 7122, 7440, 8001, 8549, 8923, 9254, 9426, 9721, 10177, 10311],"469777927":[0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0],"469777928":[1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1]}">

ядер – 141 в одном поле зрения (табл. 1).

Рис.1. Влияние сукцината 1 мМ на дифференцировку клеток линии С2С12. Фазово- контрастная микроскопия, ув. ×200. Окраска ядер по Романовскому-Гимзе.

Таблица 1 – Оценка индекса миогенеза, длины, ширины клеток линии С2С12.

Исследуемая экспериментальная группа	Значения индекса слияния клеток,%	Длина клеток, мкм	Ширина клеток, мкм
Клетки до дифференцировки	0	71,65±15,97	26,42±7,16
1 день дифференцировки	15,4 ± 5,2	122,52±54,64	15,35±6,79
4 день дифференцировки	44,3±13,8	128,11±58,02	16,01±5,61
Сукцинат 1 мМ, 1 день дифференцировки	81,9±2,9* *p<0,0001	157,45±40,52* *р=0,0122	22,87±12,27
Сукцинат 1 мМ, 4 день дифференцировки	74,8±2,9* *p<0,0001	260,94±107,81* *p<0,0001	39,83±18,48

Примечание: *p≤0,05 – относительно дней дифференцировки.

MyoD (myogenic differentiation 1) является главным транскрипционным фактором, регулирующим ранний этап миогенеза. Относительное количество MyoD в клетках линии С2С12 на раннем и среднем этапе дифференцировки возрастало на 35,3% (р=0,0002) и 53,3% (р<0,0001) (рис. 2).

На 1 день дифференцировки при воздействии сукцината в концентрации 1 мМ относительное количество MyoD возрастало на 43,0% (р<0,0001). На 4 день дифференцировки относительное количество MyoD возрастало при добавлении сукцината в концентрации 1 мМ 169,8% (р<0,0001) соответственно относительно значений 4 дня дифференцировки (рис. 3).

Рис.2. Относительное количество MyoD в клетках линии С2С12.

Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению с группой клеток

до дифференцировки, р<0,05. Слева – фото бендов, полученных с помощью ChemiDocXRS+; справа – денситометрический анализ, выполненный с помощью специализированного программного обеспечения.

Рис. 3. Относительное количество MyoD в клетках линии С2С12 при воздействии сукцината в концентрации 1 мМ в течение 1 и 4 дней.

Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению с группами клеток в 1 и 4 день дифференцировки, р<0,05. Слева – фото бендов, полученных с помощью ChemiDocXRS+;

справа – денситометрический анализ, выполненный с помощью специализированного программного обеспечения.

Клеточная линия мышиных миобластов С2С12 является универсальной моделью для изучения роста и развития мышечной ткани [8]. Данные клетки используют так же для изучения различных типов миодистрофий и миопатий, для исследования механизма действия лекарственных препаратов, гормонов и других биологически активных веществ. Удаление среды с 10% эмбриональной бычьей сывороткой и переход на 2% лошадиную сыворотку индуцирует миогенную дифференцировку клеток. Поэтому С2С12 широко применяются в исследованиях миогенеза и механизмов регенерации мышечной ткани [9].

Миогенез – сложный многостадийный процесс развития мышечной ткани, который может протекать в эмбриональном этапе, так и в постэмбриональном в ответ на повреждение миоволокон. Существует множество веществ, которые могут влиять на процесс миогенеза. К естественным веществам, регулирующим миогенез, относятся гормоны, витамины, микроэлементы и другие биологически активные вещества. Они могут оказывать как самостоятельное действие на специфические транскрипционные факторы мышечной ткани, так и через сигнальные пути клетки. Прямое действие на миогенез оказывают транскрипционные факторы MRF (myogenic regulation factors), к ним относятся MyoD, Myf-5, MRF4 и MyoG. MyoD является основным регулятором раннего этапа дифференцировки и может оказывать влияние на экспрессию специфичных для мышечной ткани генов: М-кадгерина, миогенина, тяжелые и легкие цепи миозина, белки семейства Six, MEF2, КК ММ, регуляторов клеточного цикла (р21) и микроРНК [10].

В ходе работы было показано, что сукцинат в концентрации 1 мМ ускоряет процесс миогенной дифференцировки миобластов, о чем свидетельствует увеличение индекса миогенеза, а также изменения размеров клеток. Также стимулирующее действие сукцината в концентрации 1 мМ подтверждается результатами анализа вестерн-блот, показывающих увеличение относительного количества основного регулятора дифференцировки – MyoD.

Таким образом, сукцинат в концентрации 1 мМ можно рассматривать как перспективное вещество для быстрой стимуляции регенерации мышечной ткани для спортсменов после тяжелых мышечных нагрузок и для космонавтов при адаптации после длительного пребывания в невесомости.

Выводы. В настоящем исследовании на клеточной линии С2С12 показано, что сукцинат в концентрации 1 мМ стимулирует ускоренную дифференцировку миобластов, действуя через MyoD-опосредованный механизм и стимулируя формирование миотрубочек в первые дни дифференцировки.