PREPARATION AND PROPERTIES OF MICROGEL DISPERSIONS OF POLY-N-ISOPROPYLACRYLAMIDE


Cite item

Full Text

Abstract

A series of poly-N-isopropylacrylamide (p-NIPAM) microgels using N,N'-methylenebisacrylamide (0.25, 5.0, and 10.0 mol %) as a cross-linker was obtained by radical precipitation polymerization in an aqueous solutions without using of surfactants. A sample of a cross-linked microgel (5.0 mol.%) was obtained using sodium dodecyl sulfate as an emulgator. The hydrodynamic radius of particles were measured by dynamic light scattering, which amounted to 260–400 nm for dispersions obtained in the absence of an emulgator and 145 nm for dispersions obtained in the presence of sodium dodecyl sulfate. The differences can be explained by the processes of adsorption of the emulgator on the surface of polymer particles and the appearance of an electrostatic stability factor. The ζ-potentials of particles were measured by microelectrophoresis, which amounted to -0.84 mV and -6.57 mV for dispersions obtained in the absence and presence of sodium dodecyl sulfate, respectively. This proves the phenomenon of adsorption of the ionic surfactant at the "solution-polymer" interface.  Thermoresponsivity curves for the synthesized microgels (heating and cooling) were obtained by dynamic light scattering at the temperature varied from 20 to 45°C. The dispersions demonstrate the classical behavior for a thermosensitive microgel, which appears on the graphs as a hysteresis loop.

Full Text

Актуальность. Для быстрого и точного выявления COVID-19 необходимы высокочувствительные диагностические методы, которые напрямую идентифицируют вирусные антигены в клинических образцах с минимальными предварительной подготовкой образцов. Использование электрохимических сенсоров представляет собой весьма многообещающий способ ускоренной диагностики для идентификации высококонтагиозных вирусов. Кроме того, селективность, точность и специфичность сенсоров можно повысить, введя элементы распознавания с высоким сродством, таких как наночастицы металлов.

Микрогели выделяются среди новых композитных материалов из-за их уникальной химической функциональности, макромолекулярной структуры, биосовместимости и способности к обратимой деформации, что приводит к новым применениям в сенсорной области [1, 2]. В частности, микрогелевые дисперсии поли-N-изопропилакриламила прекрасно могут адсорбировать наночастицы золота, которые легко связываются с биомолекулами. Гидрогели поли-N-изопропилакриламила широко известны способностью изменять свои адсорбционные характеристики, прозрачность и объежм частиц под воздействием внешних факторов (pH, температура, ИК-излучение и др). [3, 4]

Феноменальные свойства “smart”-гидрогелей p-NIPAM позволяют выполнять различные интеллектуальные функции, такие как изменение формы, саморегулирование и разрушение, подобно клетке и некоторым биологическим системам. Например, изменение объема позволяет таким гелям управлять транспортировкой материала (т. е. блокируя или открывая каналы путем набухания или сжатия), что имеет решающее значение в области smart-клапанов, очистки воды, доставки лекарств, генов и т.д.

Для водных растворов p-NIPAM характерен температурно-зависимый фазовый переход при 32°С, что приводит к изменению его гидрофобно-гидрофильных свойств. Эта точка отвечает важному медико-биологическому диапазону (32-34°С). Причем, процесс фазового перехода, может регулироваться включением в структуру основной полимерной цепи гидрофобных (снижают НКТР) и гидрофильных мономеров (повышают НКТР). [5, 6, 9, 21]. Примечательно, что поверхности, модифицированные p-NIPAM, приобретают способность к гидрофильно-гидрофобным изменениям за счет темочувствительности полимера. Такая «модификация» инициирует температурно-модулированные взаимодействия с биомолекулами, белками и клетками. Это неотъемлемое свойство p-NIPAM может быть эффективно использовано в различных биомедицинских приложениях, особенно в биологическом разделении и очистки белков [7], а также тканевой инженерии и регенеративной медицине. Среди исследовательских работ большое внимание уделяется разработке микро-носителей или субстрата для клеточных культур на основе p-NIPAM и его сополимеров. [8-12, 25, 31] Сообщается об успешном использования p-NIPAM в культивировании клеток с использованием различных методов создания чашек для высевания и выращивания клеточных монослоев. [13-19] 

Среди наиболее перспективных областей применения p-NIPAM отдельно отмечают разработку систем доставки лекарственных препаратов. Превосходная биосовместимость в сочетании с чувствительностью к внешним стимулам (pH, температура и т.д.) делает этот полимер потенциально привлекательным в качестве носителя для контролируемого высвобождения фармпрепаратов, а также их таргетной доставки. Такие системы позволят внутривенно вводить липофильные вещества, улучшить стабильность подверженных разложению препаратов и их биодоступность. [20, 26] Например, есть ряд исследований по разработке smart-систем доставки ацетаминофена [22], ресвератрола [23], метотрексата [24], цисплатина [27], триклозана [28], доксорубицина [29], кетотифена фумарата [30] и др.

В данной работе проводится оптимизация схем синтеза микрогелевых дисперсий p-NIPAM и изучение влияния условий синтеза на коллоидные характеристики дисперсной системы, потенциально пригодной для создания биосенсоров для идентификации шиповидного белка SARS-COV-2. [1, 32]

Материал и методы исследования. В работе использовались N-изопропилакриламид (NIPAM ≥99%), N,N'-метилен-бис-акриламид (MBAA ≥99%) (Sigma-Aldrich). В качестве эмульгатора и инициатора применялись додецилсульфат натрия (DDS) и персульфат калия (KPS) соответственно.

Синтез микрогелевых дисперсий.

Способы получения микрогелевых дисперсий разрабатывались на основе методик представленных в работах [33] и [34].

Предварительно NIPAM и MBAA очищали перекристаллизацией, используя для очистки мономера смесь петролейного эфира и толуола (1:1), а для сшивающего агента – метанол.

В соответствие с методикой [33] в трехгорлую круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником и магнитной мешалкой, поместили 1.132 г мономера (NIPAM, 0.01 моль) и соответствующее количество сшивающего агента MBAA (0.25 мол.%, 5 мол.% и 10 мол.% от количества вещества мономера), растворенных в 99 мл дистиллированной воды. При постепенном нагревании и постоянном перемешивании (250 об./мин) через систему пропускали аргон для удаления кислорода в течение 30-40 мин. Далее температуру раствора постепенно повышали до 68-70 °С, после чего добавили 1 мл 0.08М раствора ПСК. Полимеризационный процесс продолжался на протяжении 4-х часов в инертной атмосфере. По истечении времени синтеза, нагрев отключали, и полученная молочно-белая дисперсия остывала естественным путем в условиях постоянного перемешивания.

Синтез с эмульгатором, описанный в работе [34], осуществлялся по аналогичной схеме. В реактор с обратным холодильником и магнитной мешалкой (250 об./мин) в 94 мл дистиллированной воды поместили 1.4 г NIPAM, (0.0124 моль), 0.1 г MBAA (5 мол%) и 0.0188 г DDS. Раствор нагревали до 70 °С, после чего добавили 0.056 г KPS в 6 мл воды. Полимеризация длилась 4 часа.

Чтобы избавиться от остатков мономера, DDS, продуктов распада KPS и олигомеров, полученные дисперсии подвергали очистке диализом в течение 7 дней с заменой воды и контролем изменения удельной электропроводности растворителя.

Динамическое светорассеяние и электрофорез.

Гидродинамический радиус определен динамическим светорассеянием (ДСР) при помощи многоуглового анализатора размеров частиц Photocor Complex (Фотокор, Россия). Корреляционные функции получены при постоянном угле рассеяния 90° с использованием в качестве источника света гелий-неонового лазера (λ= 632,8 нм, 35 мВт). Термочувствительность измерена в диапазоне температур от 20°С до 45°С при угле 90°. Для измерений все образцы золей разбавляли в 66 раз и отфильтровывали через шприц-фильтр (диаметр пор 450 нм, материал фильтра – полиэфирсульфон (PES)).

Для измерения электрокинетического потенциала использовали метод микроэлектрофореза с использованием высокоэффективного двухуглового анализатора Zetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания).

Полученные результаты и их обсуждение. При разных условиях (без DDS и в присутствии эмульгатора) была получена серия микрогелей поли-N-изопропилакриламида с определенным содержанием сшивающего агента (0.25, 5 и 10 мол.% от количества вещества мономера) по методу радикальной осадительной полимеризации. Гидродинамические радиусы частиц измерены при помощи динамического светорассеяния. Полученные характеристики микрогелей представлены в таблице 1. Для простоты обозначений все образцы промаркированы как «p-NIPAM-x», где х – мольная доля сшивающего агента. Образцы полученные с использованием эмульгатора отмечены аббревиатурой DDS.

В ходе экспериментальной работы для абсолютно всех дисперсий наблюдалась спонтанная коагуляция, возникающая при охлаждении системы, когда температура достигала 38-40°С. При дальнейшем остывании и остановке перемешивания микрогели восстанавливали свою дисперсность, снова принимая вид молочно-белых коллоидных растворов. Это явление объясняется фазовым переходом микрогелей p-NIPAM как правило отвечающем диапазону 32-38 °С.

Также установлено, что процесс полимеризации во многом зависит от способа перемешивания раствора. При использовании верхнеприводной мешалки с лопастями идет только олигомеризация мономера, независимо от условий и времени протекания реакции. Вероятно, в таком варианте выполнения синтеза частота столкновения частиц в турбулентном потоке существенно выше, чем при использовании магнитной мешалки, что приводит к разрушению формирующейся структуры глобул.

Таблица – Коллоидные характеристики микрогелевых дисперсий p-NIPAM.

Микрогель

Гидродинамический радиус частиц Rh, нм

Содержание фракции после диализа, %

ζ-потенциал, мВ

до очистки

после очистки

p-NIPAM-0,25

406,7

392,3

95,5

-

p-NIPAM-5

419,8

446,4

99,8

-0,838

p-NIPAM-10

200,9

259,3

89,8

-

p-NIPAM-5 (DDS)

149,1

145,3

100

-6,57

 

Значения, приведенные в таблице, получены при 20°С. Здесь также включено значение ζ-потенциала только для одного образца p-NIPAM, полученного без DDS, поскольку остальные дисперсии синтезированы аналогично в отсутствие эмульгатора, а изучаемая система не имеет других факторов, формирующих поверхностный заряд.

Как видно из табличных данных микрогели полученные в присутствии эмульгатора обладают меньшим радиусом. Наиболее вероятно, это связано с процессами адсорбции DDS на поверхности полимерных частиц. Адсорбируясь на межфазной границе «раствор-полимер» DDS диссоциирует, создавая на частице небольшой отрицательный заряд за счет возникновения OSO3-групп в ионном виде. Таким образом, у частицы возникает одновременно электростатический и структурно-механический фактор устойчивости, что одновременно повышает агрегативную устойчивость и препятствует эффективному столкновению коллоидных частиц. Микрогели, синтезированные без DDS такими свойствами не обладают в силу отсутствия в составе изначальной смеси эмульгатора ионного типа. Этот факт подтверждается значениями электрокинетического потенциала золей. При этом значения ζ-потенциала довольно сложно интерпретировать для больших гелеобразных частиц, таких как микрогели p-NIPAM, и поэтому знак служит только показателем слегка отрицательного поверхностного заряда микрогеля. [32] Как и ожидалось микрогели полученные без эмульгатора практически не заряжены, в то время как дисперсии синтезированные с DDS имеют слабый отрицательный поверхностный заряд. 

Все микрогели демонстрировали склонность к монодисперсности и достаточно узкому распределению по размерам. На рис. 1 приводятся примеры диаграммы распределения по размерам.

 а)

 б)

Рис. 1. Диаграмма распределения по размерам частиц
a) p-NIPAM-5 (доля основной фракции 99.8%);
b) p-NIPAM-5(DDS) (доля основной фракции 100%).

Также получены кривые термочувствительности для синтезированных микрогелей (нагревание и охлаждение) при изменении температуры от 20 до 45 °С (рис 2.).

 

Рис. 2. Кривые изменения гидродинамического радиуса частиц Rh от температуры дисперсии для p-NIPAM-5 и p-NIPAM-5 (DDS)

 

Для обеих дисперсий наблюдается типичное для полимеров с НКТР резкое уменьшение размеров частиц по мере увеличения температуры. Обладая полярными фрагментами в макромолекуле (карбонильной группой –C=O и вторичной аминогруппой –NH–), p-NIPAM демонстрирует достаточное высокое сродство к полярным растворителем, в том числе и воде. Однако при нагревании происходит разрушение специфических связей полярных групп в полимерной цепочке с диполями растворителя (дегидратация и последующее сжатие), и как следствие к формированию отдельной полимерной фазы, что визуально может выражаеться в помутнении дисперсии, расслоении жидкости, выпадении осадка и т.д.

Выводы. В ходе работы получена серия микрогелей p-NIPAM по двум разным методикам и разным содержанием сшивающего агента MBAA (0.25, 5.0 и 10.0 мол.%). Методом динамического светорассеяния подтверждено, что размеры микрогелевых частиц, синтезированных в присутствии эмульгатора (~150 нм), меньше чем у дисперсии, полученных в его отсутствии (~260-400 нм). Это обусловлено адсорбцией DDS на поверхности частиц и его диссоциацией в полярном растворителе, и, как следствие, возникновением дополнительного электростатического фактора сдерживания роста частиц дисперсии. 

Более предпочтительным является метод синтеза микрогелей без эмульгатора, поскольку введение дополнительного вещества даже в небольших количествах затрудняет очистку дисперсий и уменьшает возможности применения таких микрогелей, особенно в таргетной доставки ЛС. Сам по себе p-NIPAM идеально подходит для использования в медицинских целях благодаря своей термочувствительности, биосовместимости и высокой адсорбционной способности к ионам или наночастицам металлов, что делает разработки в области создания специфических биосенсоров на его основе весьма перспективными.

×

About the authors

Alexander S Shestakov

ФГБОУ ВО ВГУ

Author for correspondence.
Email: shestakov@chem.vsu.ru

д.х.н., доцент и заведующий кафедрой высокомолекулярных соединений и коллоидной химии

Russian Federation

Peter O Kushchev

ФГБОУ ВО ВГУ

Email: Peter.kuschev@gmail.com

к.х.н., доцент кафедры высокомолекулярных соединений и коллоидной химии

Russian Federation

Irina Y Samotina

ФГБОУ ВО ВГУ

Email: oap@vrngmu.com

преподаватель кафедры высокомолекулярных соединений и коллоидной химии 

Russian Federation

References

  1. Highly Sensitive Poly-N-isopropylacrylamide Microgel-based Electrochemical Biosensor for the Detection of SARS-COV-2 Spike Protein / H. Chen [et al.] // Biomedical and Environmental Sci. – 2023. – Vol. 36 (3). – P. 269-278.
  2. Plamper F. A. Functional microgels and microgel systems / F. A. Plamper, W. Richtering //Acc. Chem. Res. – 2017. – Vol. 50. – P. 131−40.
  3. Recent developments in design and functionalization of micro- and nanostructural environmentally-sensitive hydrogels based on N-isopropylacrylamide / M. Karbarz [et al.] // Applied Materials Today. – 2017. – Vol. 9. – P. 516–532.
  4. Коллапс полимерных гидрогелей на основе N-изопропилакриламида и винилсульфоната натрия / Е. Ю Кожунова. [и др.] // Вестник Московского университета. Серия 3. Физика. Астрономия. – 2012. - №4. – С. 51-54.
  5. Poly(N-isopropylacrylamide)-based thermoresponsive surfaces provide new types of biomedical applications / K. Nagase [et al.] / Biomaterials. – 2018. – Vol. 153. – P. 27-48.
  6. Effect of comonomer hydrophilicity and ionization on the lower critical solution temperature of N-isopropylacrylamide copolymers / Herman Feil [et al.] // Macromolecules. – 1993. – Vol. 26. – № 10. – P. 2496–2500.
  7. Thermally-modulated on/off-adsorption materials for pharmaceutical protein purification / K. Nagase [et al.] // Biomaterials. – 2011. – Vol. 32 (2). – P. 619-627.
  8. Poly(N-isopropylacrylamide)-based smart hydrogels: Design, properties and applications / L. Tang, [et al.] // Prog. Mater Sci. – 2021. – Vol. – 115.
  9. Kurisawa M. Gene expression control by temperature with thermoresponsive polymeric gene carriers / M. Kurisawa, M. Yokoyama, T. Okano // J. Controlled Release. – 2000. – Vol. 69(1). – P. 127-137.
  10. Nagase K. Thermoresponsive interfaces obtained using poly (N-isopropylacrylamide)-based copolymer for bioseparation and tissue engineering applications / K. Nagase // Adv. Colloid Interface Sci. – 2021. – Vol. 295 (102487)
  11. Temperature-responsive poly(N-isopropylacrylamide)-grafted microcarriers for large-scale non-invasive harvest of anchorage-dependent cells / A. Tamura [et al.] // Biomaterials. – 2012. – Vol. 33. – P. 3803-3812.
  12. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine / K. Matsuura [et al.] // J. Controlled Release. – 2014. – Vol. 190. – P. 228-239.
  13. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells / N. Yamada [et al.] // Makromol. Chem., Rapid Commun. – 1990. – Vol. 11. – P. 571-576.
  14. Akiyama Y. Ultrathin Poly(N-isopropylacrylamide) Grafted Layer on Polystyrene Surfaces for Cell Adhesion/Detachment Control / Y. Akiyama, A. Kikuchi, M. Yamato, T. Okano // Langmuir. – 2004. – Vol. 20. – P. 5506-5511.
  15. Copolymerization of 2-Carboxyisopropylacrylamide with N-Isopropylacrylamide Accelerates Cell Detachment from Grafted Surfaces by Reducing Temperature // M. Ebara [et al.] // Biomacromolecules. – 2003. – Vol. 4. – P. 344-349.
  16. Switching of cell growth/detachment on heparin-functionalized thermoresponsive surface for rapid cell sheet fabrication and manipulation / Y. Arisaka [et al.] // Biomaterials. – 2013. – Vol. 34. – P. 4214-4222.
  17. Preparation of thermoresponsive polymer brush surfaces and their interaction with cells / A. Mizutani [et al.] // Biomaterials. – 2008. – Vol. 29 (13). – P. 2073-2081.
  18. Thermo-responsive polymer brushes as intelligent biointerfaces: preparation via ATRP and characterization / K. Nagase [et al.] // Macromol. Biosci. – 2011. – Vol.11. – P.400-409.
  19. Rapid cell sheet detachment from poly(N-isopropylacrylamide)-grafted porous cell culture membranes / OH Kwon [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. – 2000. Vol. 50. – P.82–89.
  20. Moghadam S. Assessing the Efficacy of Poly(N isopropylacrylamide) for Drug Delivery Applications Using Molecular Dynamics Simulations / S. Moghadam, R. G. Larson // Mol. Pharmaceutics. – 2017. – Vol. 14. – P.478-491.
  21. PNIPAM Poly (N-isopropylacrylamide): A Thermoresponsive “Smart” Polymer in Novel Drug Delivery Systems / Kokardekar [et al.] // Internet Journal of Medical Update. – 2012. – Vol. 7. - №2. – P.60-62.
  22. Thermoresponsive nanocomposite hydrogels based on Gelatin/poly (N–isopropylacrylamide) (PNIPAM) for controlled drug delivery / P. Gheysoori [et al.] // Eur. Polym. J. – 2023. – Vol. 186 (111846).
  23. Folic acid-poly(N-isopropylacrylamide-maltodextrin) nanohydrogels as novel thermo-/pH-responsive polymer for resveratrol breast cancer targeted therapy / Osama R.M. Metawea [et al.] // Eur. Polym. J. – 2023. – Vol. 182 (111721). – P. 1-15.
  24. Triple-responsive drug nanocarrier: Magnetic core-shell nanoparticles of Fe3O4@poly(N-isopropylacrylamide)-grafted-chitosan, synthesis and in vitro cytotoxicity evaluation against human lung and breast cancer cells / // Journal of Drug Delivery Science and Technology. – 2022. – Vol. 72. (103426).
  25. Останкова И.В. Получение конъюгированных гидрогелей на основе поли-N-изопропилакриламида, внеклеточного матрикса и тромбоцитарного лизата и их применение в медицине / И.В. Останкова, Р.А. Полтавцева, А.Ю. Пульвер, Н.А. Пульвер // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. – 2022. – Т. 21. – №4. – С. 80-86.
  26. Biobased thermo/pH sensitive poly(N-isopropylacrylamide-co-crotonic acid) hydrogels for targeted drug delivery / M. D. Markovic [et al.] // Microporous and Mesoporous Materials. – 2022. – Vol. 335 (111817).
  27. Biocompatibility study of P(N-isopropylacrylamide)-based nanocomposite and its cytotoxic effect on HeLa cells as a drug delivery system for Cisplatin / Z. Shakoori [et al.] // Journal of Drug Delivery Science and Technology. – 2022. – Vol. 71 (103254).
  28. Preparation of thermoresponsive triclosan poly (N-isopropylacrylamide) nanogels and evaluation of antibacterial efficacy on Cutibacterium acnes / A. Yurdasiper, A. Şahiner, E. Homan Gökçe // Journal of Drug Delivery Science and Technology. – 2022. – Vol. 76 (103734).
  29. A nanosized photothermal responsive core-shell carbonized polymer dots based on poly(N-isopropylacrylamide) for light-triggered drug release / G. Forte // Colloids Surf., B. – 2022. – Vol. 217 (112628).
  30. Thermo-sensitivity and erosion of chitosan crosslinked poly[N-isopropylacrylamide-co-(acrylic acid)-co-(methyl methacrylate)] hydrogels for application to the inferior fornix / M. Ross [et al.] // Acta Biomaterialia. – 2022. – Vol. 141 – P. 151-163.
  31. Temperature responsive hydrogel for cells encapsulation based on graphene oxide reinforced poly(N- isopropylacrylamide)/hydroxyethyl-chitosan / L. Nie [et al.] // Materialstoday Communications. – 2022. – Vol. 31 (103697).
  32. Rapid, Ultrasensitive, and Quantitative Detection of SARS-CoV-2 Using Antisense Oligonucleotides Directed Electrochemical Biosensor Chip / M. Alafeef [et al.] // ACS Nano. – 2020. – Vol. 14. – P. 17028-17045.
  33. Interaction of gold nanoparticles with thermoresponsive microgels: influence of the cross-linker density on optical properties / K. Gawlitza [et al.] // Phys. Chem. Chem. Phys. – 2013. – Vol. 15. – P. 15623-15631.
  34. McPhee W. Poly(N-isopropylacrylamide) Latices Prepared with Sodium Dodecyl Sulfate / W. McPhee, K. Chiu Tam, R. Pelton // J. Colloid Interface Sci. – 1993. – Vol. 156(1). – P. 24-30.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies