APPLICATION OF GAS CHEMOSENSORS BASED ON CdS QUANTUM DOTS FOR DIAGNOSTICS OF INFLAMMATION IN THE GYNECOLOGICAL TESTS

Full Text

Актуальность. Наноматериалы благоприятно влияют на свойства сенсоров: повышают время их активной эксплуатации, снижают шум, пределы обнаружения, создают условия для определения отдельных летучих органических соединений (ЛОС) в смеси, существенно сокращают время отклика [1]. Применение высокочувствительных детекторов с наноматериалами в качестве сорбентов позволяет выявить присутствие ЛОС даже незначительно малых концентраций, в том числе, в биологических пробах. Примером таких интеграционных систем является «нос-диагност» на пьезосенсорах, хорошо зарекомендовавший себя при анализе биопроб разной природы: носовой, гинекологической слизи, крови, выделений кожи, и применяющийся для решения различных диагностических задач. С учетом малого объема, времени стабильности биопроб перспективной задачей остается поиск высокоселективных сорбентов для быстрого определения присутствия в них целевых аналитов.

Теоретические данные и практические наработки позволяют сделать предположение о возможности применения квантовых точек (КТ), как модификаторов сенсоров газового анализатора «электронный нос», существенно влияющих на изменение селективности определения летучих биомаркеров. Высокая селективность при этом может определяться природой КТ и модифицирующими реагентами. Выявление присутствия биомаркеров негативных процессов в биопробе позволяет диагностировать воспаления различной природы. Это важно для ранней диагностики, так как многие процессы, в частности, гинекологические воспаления, могут протекать бессимптомно. В настоящее время гинекологические заболевания приоритетны не только у людей, но и у крупного рогатого скота. Послеродовый метрит рассматривается как типичная факторная инфекционная патология [2-4], обусловленная инфицированием родовых путей ассоциациями различных патогенных и потенциально патогенных микроорганизмов, а также в отдельных случаях присутствием грибов [2, 3, 5, 6]. На поздних этапах послеродовой метрит может приводить к снижению поголовья животных. Диагностика данного заболевания на раннем этапе является важной задачей, имеющей колоссальные экономические последствия.

Цель работы – разработка способа выявления и мониторинга воспалений эндометрия у коров по запаху цервикальной слизи с применением «электронного носа» на основе КТ CdS модифицированных и без модификаций родамином 6Ж.

Материал и методы исследования. Основной метод исследования - пьезокварцевое микровзвешивание массивом сенсоров с разной селективностью и чувствительностью к парам тест-веществ. В качестве чувствительных слоев сенсоров были выбраны модифицированные родамином 6Ж (0,25-1,0 % мас.) и без модификаций КТ CdS, полученные коллоидным синтезом. Тест-вещества для обучения сенсоров - летучие метаболиты - широко распространенные биомаркеры воспалений, которыми, согласно базам данных, являются кетоны, карбоновые кислоты, амины [7]. Анализируемые биопробы – цервикально-вагинальные выделения коров, основная характеристика которых согласно заключению ветеринара представлена в таблице 1.

Таблица 1 – Заключение ветеринара по состоянию здоровья коров

Номера проб слизи	Краткая характеристика
1	Жидкая слизистая пробка, здорова
2	Гнойно-катаральный эндометрит
3	Гнойно-катаральный эндометрит
4	Гнойно-катаральный эндометрит, начальная стадия
5	Гнойно-катаральный эндометрит, начальная стадия

 

Для выявления присутствия летучих органических соединений (ЛОС) слизь отбирали туфером помещали на чашку Петри и накрывали ячейкой прибора «Нос-диагност», в котором установлены сенсоры с базовой частотой колебаний 10 МГц и фазами квантовых точек сульфида кадмия в хитозановой оболочке без и с дополнительной модификацией родамином 6 Ж массой 4-6 мкг. Фиксировали в ПО прибора сигналы сенсоров за 80 с нагрузки ЛОС, выделяющимися биопробой. Далее прибор устанавливали на подставку для самопроизвольной десорбции соединений.

Для проверки правильности оценки состояния животного и выраженности воспаления матки применяли тест-систему с люмофорным реагентом. Диагностика воспаления у коров с применением флуорохрома - 6-оксо-2-фенилимидазо[1, 2-b]пиридо[4,3-е][1, 2, 4]триазин-7(6Н)-ил)уксусной кислоты [26], включала отбор 5-10 мл цервикальной слизи у коровы, двукратное разбавление водой, добавление в раствор флуорохрома с последующей регистрацией визуальных изменений интенсивности и окраски по сравнению с исходным (нулевым) состоянием реагент [8]. Полученные результаты обоих методов сопоставляли с данными ветеринарного осмотра.

Полученные результаты и их обсуждение. На первом этапе исследования обучали сенсоры по приоритетным тест-веществам. Для выбранных аналитов устанавливали параметры Аi/j [9], которые использовали в дальнейшем для их обнаружения в биопробах. В качестве наиболее информативных сигналов работы сенсоров выбрали значения ΔFτ (Гц) – изменение частоты колебаний кварцевой пластины в определенные моменты времени нагрузки τ, и ΔFmax (Гц) – максимальное изменение частот колебаний сенсоров за 80 с. Задачи качественного анализа соединений, регистрируемых выбранным массивом сенсоров, решали по параметрам парной эффективности сорбции Аi/j – отношение максимальных сигналов отдельных пьезосенсоров ΔFmaxi/ΔFmaxj (где i, j – различные покрытия электродов/номера сенсоров в массиве). Этот параметр характеризует соотношение в пробе концентрации различных классов соединений и идентичен для разбавленных смесей паров коэффициенту селективности – отношению чувствительностей микровзвешивания веществ двумя сорбентами (таблица 2).

Таблица 2. Аналитические сигналы сенсоров ΔFmax (Гц) при экспонировании в парах веществ-стандартов и рассчитанные параметры парной чувствительности

Стандарты	S1	S2	S3	S5	S6	S7	S8	A(7/8)	А(5/8)
Сорбенты на сенсорах	CdS с родамином 6Ж					CdS разной массы		CdS1/CdS2	CdS|R6G/CdS2
Вода	9	13	23	18	15	45	217	0,21± 0,05	0,08±0,02
Этанол, 70 % об.	7	37	22	48	27	35	136	0,28±0,03	0,35±0,05
Бутанол-2	6	21	10	19	15	16	53	0,36±0,04	0,36±0,05
Этилацетат	12	54	31	75	34	52	287	0,18±0,01	0,26±0,03
Метилэтилкетон	6	25	9	28	19	15	83	0,18±0,03	0,34±0,03
Молочная кислота	3	5	5	6	21	7	30	0,23±0,05	0,20±0,02
Пировиноградная кислота	25	8	10	25	56	27	48	0,56±0,02	0,52±0,05
Пропиламин	26	134	109	193	92	141	140	1,0±0,1	1,4±0,2
Н.бутиламин	263	1089	839	1054	539	1377	1067	1,3±0,1	1,0±0,1
Изобутиламин	352	1945	926	1195	563	1711	1318	1,1±0,2	0,91±0,07
Циклопентиламин	58	262	183	151	68	269	313	0,86±0,05	0,48±0,05
Метоксиэтанамин	76	352	101	89	50	190	255	0,85±0,15	0,35±0,05

 

В таблице гарниту́рой шрифта выделены параметры парной чувствительности для сенсоров на основе КТ CdS, относящиеся к летучим аминам линейного и циклического строения, которые высоко селективно позволяют отличить их от других соединений в смеси. Дополнительная модификация капсулированных КТ CdS родамином 6Ж приводит к незначительному изменению избирательности практически ко всем выбранным тест-веществам, кроме воды, метилэтилкетона, циклопентиламина, метоксиэтанамина и не изменяет параметры парной чувствительности к алкиламинам. Т.е. дополнительная модификация КТ повышает селективность микровзвешивания паров линейных алкиламинов.

Анализ полученных при обучении «носа-диагноста» откликов массива сенсоров позволяет сделать вывод о его селективности к аминам - маркерам воспалений [10]. А наборы различающихся параметров Аi/j для проб могут быть применены для классификаций состава летучих соединений над биопробами по сигналам массива сенсоров с CdS внутри выборки.

Для оценки возможностей газовых сенсоров на основе КТ и дифференциации летучих органических соединений непосредственно в пробах слизи коров был применен авторский подход колориметрического ранжирования [11]. В идентичных условиях были исследованы 5 проб цервикальной слизи с двукратным повторением измерения. Полученные результаты проанализированы, выбраны наиболее информативные, т.е. значимо, с учетом статобработки, различающиеся для проб в выборке параметры Ai/j. Далее этим параметрам присвоены цветовые метки в соответствие с полученными значениями.

Таблица 3. Цветовые метки параметров в соответствие с полученными значениями

Диапазон значений	Цветовая метка
Меньше 0,10
0,10-0,25
0,26-0,59
0,60-0,99
1,0-5,0
Больше 5,0

 

В разработанной авторами программе сформирован единый цветовой код в системе RGB по совокупности полученных цветовых меток набора параметров Ai/j (табл. 4). Принято, что максимальная дифференциация на данном массиве сорбентов характерна для проб с наиболее несовпадающим набором цветовых меток.

Таблица 4 – Цветовая кодировка набора селективных параметров парной чувствительности и полученный суммарный цвет ранга проб слизи коров

Пробы / Номер параметра Ai/j	1	2	3	4	5	6	7	8	RGB
Проба 5 2	0,96	0,26	0,75	0,32	1,67	0,45	0,14	0,48
Проба 4 1	0.89	0,26	0,70	0,20	1,51	0,26	0,08	0,30
Проба 3 2	0,98	0,27	0,78	0,23	1,65	0,33	0,10	0,36
Проба 5 1	0,93	0,25	0,72	0,28	1,72	0,39	0,12	0,47
Проба 2 2	0,96	0,19	0,54	0,40	1,66	0,41	0,13	0,44
Проба 4 2	0,89	0,26	0,69	0,16	1,48	0,22	0,06	0,23
Проба 3 1	0,95	0,27	0,78	0,14	1,73	0,20	0,06	0,23
Проба 2 1	0,96	0,27	0,77	0,15	1,66	0,21	0,07	0,23
Проба 1 2	1,00	0,26	0,80	0,15	1,67	0,23	0,07	0,25
Проба 1 1	0,94	0,25	0,73	0,16	0,01	0,21	0,07	0,25

 

Установлено, что ранжирование с использованием единой цветовой метки в системе RGB позволяет различить все 5 биопроб, что может быть сопряжено с их разным микробиоценозом и составом ЛОС. Повторные измерения всех проб, кроме 1 (условная норма), существенно различаются, что говорит об их нестабильности. Максимально отличными от пробы 1 (условная норма) являются пробы 4 и 5 (начальная стадия эндометрита), в отдельной группе – пробы 3 и 2 (явное воспаление). По идентификационным параметрам, полученным на этапе обучения массива сенсоров, установлено присутствие аминов во всех исследованных биопробах слизи коров. Это позволяет сделать вывод о течение воспалительного процесса у каждой из пяти коров, отличающегося лишь стадией заболевания.

 Дополнительно для ранжирования проб применен способ оценки подобия набора параметров парной чувствительности Ai/j (табл. 5). В качестве стандартов выбраны пробы 2 и 3 от коров, достоверно оцененных специалистом, как с гнойно-катаральным эндометритом (явное воспаление). Полученные значения параметров подобия также закодировали цветовыми метками. С учетом нестабильности проб сравнивали только наборы параметров для первых измерений.

Таблица 5 – Оценка подобия параметров парной чувствительности для биопроб относительно стандартов (явное воспаление)

Пробы	Параметр подобия	Пробы	Параметр подобия
Стандарт – проба 2		Стандарт – проба 3
Проба 3	0,034	Проба 2	0,004
Проба 4	0,043	Проба 4	0,047
Проба 5	0,115	Проба 5	0,111
Проба 1	0,306	Проба 1	0,309

 

Как видно из таблицы 5, сравнение данных «Носа-диагноста» для проб в выборке с данными обеих проб от достоверно больных коров, идентично. Максимально не похожей по качественному составу запаха гинекологических проб на выбранные стандарты является проба 1 (условная норма). Если принять, что удаленность подобия наборов параметров парной чувствительности Ai/j связана с выраженностью воспаления, то пробы можно расположить в ряд от здоровой к сильно болеющей следующим образом: Проба 1 > Проба 5 > Проба 4 > Проба 3 ~ Проба 2.

Анализ результатов также показал необходимость ограничений времени от момента забора биоматериала до начала измерения, поскольку сильно удаленные по времени повторы измерений показали сглаживание различий для проб.

В соответствии с полученными результатами можно выделить две классификационные группы коров - «больные» (2, 3, 4 и 5) и «условно здоровые» (1), что согласуется с предварительным диагнозом специалиста.

Для оценки правильности результатов ранжирования проб по сигналам предложенного набора сенсоров на основе квантовых точек сульфида кадмия с и без родамина 6Ж и нового способа классификации применили тест-систему с органическим флуорохромом - 6-оксо-2-фенилимидазо[1, 2-b]пиридо[4,3-е][1, 2, 4] триазин-7(6Н)-ил)уксусной кислотой. Установлено, что освещении УФ лампой с длиной волны 365 нм проявляется зеленое свечение различной интенсивности, зависящее от степени воспаления матки животного. Такой аналитический отклик может служить визуальным показателем состояния здоровья животного (см. рис.).

Рис. Пример реакции биопроб с раствором флуорохрома при 365 нм,
номер пробирки соответствует номеру пробы слизи:
1, 3, 5 – несильное свечение (положительный отклик, +); 4 – интенсивное свечение (положительный отклик, ++); 2 – слабое свечение (положительный ответ, ±).

Как видно из рисунка 1, проба 1 характеризуется несильным свечением при УФ, что свидетельствует о возможном начальном этапе послеродового метрита. Пробы 2, 3, 4 и 5 также дают положительный отклик при освещении УФ лампой разной интенсивности, что свидетельствует о явном течении болезни и коррелирует с диагнозом специалиста.

Выводы. Показана возможность применения квантовых точек в качестве сорбентов газовых пьезосенсоров для быстрой диагностики присутствия аминов – маркеров воспалений. Отмечено, что селективность к аминам делает перспективным применение таких сенсоров для анализа биопроб в клинической диагностике. Установлены количественные регистрируемые и расчетные параметры ранжирования проб, а также оценена правильность и перспективность нового способа ранжирования аналитических сигналов сенсоров с применением цветовых кодов.

Показано, что выводы, полученные по результатам применения «электронного носа» и тест-системы на основе органического флуорохрома - 6-оксо-2-фенилимидазо[1, 2-b]пиридо[4,3-е][1, 2, 4]триазин-7(6Н)-ил)уксусной кислоты, хорошо согласуются между собой, а также подтверждены диагнозом специалиста.

About the authors

Tatyana A Kuchmenko

ФГБОУ ВО ВГУИТ; институт геохимии и аналитической химии им. В. И. Вернадского РАН

Author for correspondence.
Email: tak1907@mail.ru

д.хим.н, профессор РАН, зав. кафедрой физической и аналитической химии, ведущий научный сотрудник лаборатории газовых сенсоров и анализа газообразующих сред ФГБОУ ВО ВГУИТ, институт геохимии и аналитической химии им. В. И. Вернадского РАН

Russian Federation

Tatyana N Khmelevskaya

ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России

Email: tatiana_ilinova@mail.ru

к.хим.н, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко 

Russian Federation

Dmitry Y Vandyshev

ФГБОУ ВО ВГУ

Email: francy_2007@mail.ru

к.хим.н, доцент кафедры органической химии ФГБОУ ВО ВГУ

Ruslan U Umarkhanov

ФГБОУ ВО ВГУИТ

Email: 89202130512@mail.ru

к.хим.н, доцент кафедры физической и аналитической химии ФГБОУ ВО ВГУИТ

Russian Federation

Alexander V Morozov

ФГБОУ ВО ВГУ

Email: dreemer42@yandex.ru

аспирант кафедры теории функций и геометрии ФГБОУ ВО ВГУ

Russian Federation

Vladimir N Skorikov

ФГБНУ «ВНИВИПФиТ»

Email: skorikov.75@yandex.ru

к.вет.н., старший научный сотрудник лаборатории болезней органов воспроизводства и молочной железы ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии»

Russian Federation

References