GLUTATHIONE ANTIOXIDANT SYSTEM ACTIVITY IN DIABETIC NEUROPATHY PATIENTS WITH TYPE 2 DIABETES MELLITUS

Full Text

Актуальность. В настоящее время диабетом страдают примерно 381 миллион человек во всем мире, и их число быстро растет. По оценкам Всемирной организации здравоохранения, к 2030 году осложнения этого заболевания могут стать основной причиной смертности [1]. Одним из частых осложнений как диабета 1-го, так и 2-го типа является диабетическая нейропатия (ДН). Считается, что ключевым патологическим фактором повреждения периферических нервов является гипергликемиея. Точный механизм возникновения нейропатии при диабете до сих пор не выяснен, однако считается, что основной причиной является окислительный стресс, возникающий в результате индуцированного гипергликемией образования свободных радикалов. Окислительный стресс приводит к микроскопическим повреждениям сосудов, затрудняющим кровоснабжение периферических нервов. Некоторые провоспалительные цитокины, включая IL-6 и TNF-α, также повышаются при гипергликемии и способствуют повреждению нервных клеток [2]. Именно цитокины могут быть причиной развития болевых реакций, которые опосредованы наличием рецепторов фактора некроза опухоли-1 на окончаниях аксонов сенсорных нейронов. Эти рецепторы отвечают за восприятие механических, термических и химических раздражителей. При стимуляции TNF-α ноцицепторы запускают связанный с болью внутриклеточный сигнал через киназу А тропомиозинового рецептора [3].

Важную роль в защите организма от окислительного стресса выполняет глутатионовая антиоксидантная система как часть общей реакции на стрессовое воздействие. Дисбаланс между активными формами кислорода и антиоксидантами является важным звеном в патогенезе инсулинорезистентности и осложнений диабета, поскольку сигнальные пути, опосредованные инсулином, не стимулируются должным образом в условиях окислительного стресса.

Целью настоящей работы стал анализ активности глутатионовой антиоксидантной системы у больных ДН при проведении базисной терапии.

Материал и методы исследования. В исследование были включены пациенты с диабетической нейропатией находившиеся на лечении в эндокринологическом отделении БУЗ ВО «Воронежского областного клинического центра специализированных видов медицинской помощи» в период с 2018 по 2020 гг. Работа была одобрена этическим комитетом ВГМУ им Н.Н. Бурденко (протокол от 27.02.2018 № 1). Перед проведением клинического исследования получено информированное согласие всех пациентов в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской Декларации Всемирной медицинской ассоциации (64th WMA GeneralAssembly, Fortaleza, Brazil, October 2013) и Федеральном законе Российской Федерации № 323-ФЗ от 21.11.2011 г. «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации».

В исследование были включены 45 пациентов в возрасте от 57 до 77 лет с диабетической нейропатией. Контрольную группу (n=86) составили практически здоровые лица с нормальными показателями биохимического и общего анализа крови. Диагноз был поставлен на основании клинической картины заболевания, биохимического анализа крови. Критериями исключения из исследования являлись: острый инфаркт миокарда, злокачественные новообразования, острое нарушение мозгового кровообращения. Клинико-биохимические показатели анализировались при поступлении пациентов в стационар и перед выпиской.

В качестве стандартной терапии использовали следующую схему лечения, указанную в табл. 1.

Таблица 1 – Схема лечения

Показатель	Лечение
Гипогликемические пероральные препараты	Бигуаниды (метформин — 500-1500 мг 1 раз вечером) Препараты сульфонилмочевины (Гликлазид — 30-90 мг 1 р/д) Ингибиторы дипептидилпептидазы-4 (Вилдаглиптин — 50-100 мг 1-2 р/д, Алоглиптин — 12,5-25 мг 1 р/д)
Антигипертензивные препараты	АПФ-блокаторы (Эналаприл -5-20 мг 1-2 р/д, Лизиноприл 5-20 мг 1 р/д), В-адреноблокаторы (Бисопролол — 2,5-10 мг 1 р/д, Метопролола сукцинат — 50-100 мг 1 р/д)
Гиполипидемические препараты	Статины (Аторвастатин — 20-40 мг 1 р/д)
Диуретики	Тиазидные диуретики (Индапамид 2,5 мг 1 р/д)
Сартаны	Антагонист рецепторов ангиотензина 11 (Лориста 50-100 мг 1 раз в день)
Метаболическое средство	Препарат, регулирующий липидный и углеводный обмен (тиоктовая кислота 600 мг 1 раз в сутки)

 

В ходе клинического исследования использовали сыворотку крови больных. Кровь для исследования забиралась в пробирки типа «вакутейнер» в утреннее время натощак из локтевой вены.

Концентрацию восстановленного глутатиона (GSH) определяли спектрофотометрически при длине волны 412 нм по реакции с реактивом Эллмана [5]. Активность ферментов оценивали спектрофотометрически при длине волны 340 нм. Измерение активности глутатионпероксидазы (ГП, КФ 1.11.1.9) проводили по сопряженной ферментативной реакции в среде следующего состава: 50 мМ калий-фосфатный буфер (pH 7,4), содержащий 1 мМ ЭДТА, 0,12 мМ НАДФН, 0,85 мМ GSH, 0,37 мМ Н2О2, 1 ЕД/мл глутатионредуктазы (ГР, КФ 1.6.4.2). Контрольная проба не содержала GSH. Активность ГР определяли в среде спектрофотометрирования, содержащей 50 мМ калий-фосфатный буфер (pH 7,4), 1 мМ ЭДТА, 0,16 мМ НАДФН и 0,8 мМ окисленного глутатиона. Активность глутатионтрансферазы (ГТ, КФ 2.5.1.18) определяли с помощью метода, основанного на оценке скорости образования глутатион-5-2,4-ди- нитробензола в реакции GSH с 1-хлор-2,4-динитробензолом, в среде следующего состава: 0,1 М калий-фосфатный буфер (pH 7,4), 1 мМ ЭДТА, 1 мМ 1-хлор-2,4-динитробензол, 5 мМ GSH.

Результаты анализировали с помощью программ SPPS Statistics с использованием одновыборочного критерия Колмогорова-Смирнова для анализа нормальности распределения значений переменных. Значения показателей в группах сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента или критерия Манна-Уитни. Для выявления корреляционных взаимосвязей между изучаемыми переменными использовали коэффициент корреляции Пирсона для значений с нормальным распределением и коэффициент корреляции Спирмена для непараметрических показателей. В настоящей работе приводятся значения средней (0,30-0,69) и сильной (>0,70) степени корреляции. Статистически значимыми считали различия при р <0,05.

Полученные результаты и их обсуждение. Общая характеристика и биохимические показатели крови пациентов, включенных в исследование, представлены в табл. 2.

Таблица 2 – Основные характеристики, биохимические показатели крови и параметры неврологического статуса пациентов с диабетической нейропатией, получавших стандартное лечение (среднее значение ± SD)

Показатель	До лечения	После лечения	р
Возраст, лет	67±10	-	-
Длительность СД типа 2, лет	10±5	-	-
Концентрация глюкозы натощак, ммоль/л	12,86±3,38	7,18±0,80	<0,001
Концентр.глюкозы через 2 ч после ПГТТ, ммоль/л	17,05±3,66	9,31±1,38	<0,001
HbA1c, %	8,90±1,94
ИМТ, кг/м2	33±2
АсАТ, Ед/л	23,33±4,73	18,44±4,62	<0,001
АлАТ, Ед/л	24,28±3,10	21,36±4,70	0,003
Билирубин общий, мкмоль/л	13,20±3,49	11,25±3,31	0,009
Мочевина, ммоль/л	6,24±1,65	5,31±1,56	0,015
Креатинин, мкмоль/л	90,22±12,90	76,81±13,44	<0,001
Холестерин, ммоль/л	6,82±1,01	6,11±1,00	0,004
Триглицериды, ммоль/л	2,20±0,50	1,75±0,39	<0,001
Амилаза, Ед/л	137,19±59,31	111,47±53,46	0,036

При первичном обращении у пациентов были выявлены основные клинические признаки диабетической нейропатии: боли в стопах различной интенсивности, онемение, парестезии, зябкость стоп, судороги в мышцах голеней и стоп. Отмечалось снижение периферической чувствительности – вибрационной, болевой, тактильной и температурной. Концентрация глюкозы в сыворотке крови обследуемых пациентов натощак и после перорального глюкозотолерантного теста (ПгТТ) была значительно выше показателей, характерных для нормы, что объективно свидетельствует о нарушении метаболизма углеводов и развитии сахарного диабета. Помимо этого, для участников исследования были характерны повышенные уровни общего билирубина, холестерина и активности амилазы в сыворотке крови. Выявлено также снижение СРВ при развитии патологии, что может быть связано с процессами демиелинизации нервных волокон.

После проведенной терапии наблюдалось снижение уровня глюкозы натощак в 1,79 раза (р<0,001). При этом, уровень глюкозы через 2 часа после проведения ПгТТ уменьшался в 1,83 раза (р<0,001) по сравнению с данными до лечения. При этом их концентрация не достигала показателей, характерных для нормы.

В ходе исследования было установлено изменение функционального состояния глутатионовой антиоксидантной системы. Так, активность ГП и ГР в сыворотке крови больных, выраженная в виде Е/мл сыворотки, возрастала в 1,35 раза (р<0,05) (рис. 1).

 

Рис. 1. Активность глутатионпероксидазы (А) и глутатионредуктазы, выраженная
в виде Е/мл сыворотки, в исследуемых группах; * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой; ** - р<0,05 по сравнению с группой с диабетической нейропатией

 

Повышение активности ГП может быть связано с тем, что данный фермент является индуцибельным и его активность стимулируется АФК [6]. Повышенная продукция радикалов может стимулировать активность ГП для борьбы с избыточным перекисным повреждением. Согласно другому механизму, при диабете в тканях может задерживаться селен и тем самым повышать активность селензависимой ГП [7]. Другим фактором, который может вносить вклад в повышение активность ГП, являются увеличение содержания гидропероксида, продукта пероксидного повреждения липидов [8].

Содержание GSH в сыворотке крови больных диабетической нейропатией снижалось в 2,0 раза (р<0,05) по сравнению с контрольной группой (рис. 2А). Известно, что GSH является наиболее распространенным клеточным антиоксидантом, который играет важную роль в антиоксидантной защите, регулируя окислительно-восстановительное состояние и нейтрализуя свободные радикалы. Гипергликемическое состояние косвенно приводит к истощению GSH через полиоловый путь, который потребляет НАДФН, необходимый также для регенерации GSH [9].

 

Рис. 2. Содержание восстановленного глутатиона (А) и активность глутитон-трансферазы, выраженная в виде Е/мл сыворотки, в исследуемых группах

* - р<0,05 по сравнению с контрольной группой; ** - р<0,05 по сравнению с группой
с диабетической нейропатией

 

При этом активность ГТ, выраженная в виде Е/мл сыворотки, снижалась в 2,02 (р<0,05) раза, по сравнению с контрольной группой (рис. 2Б). Вероятно, активность данного фермента снижалась вследствие уменьшения основного субстрата данной реакции – GSH.

Проведение базисной терапии способствовало увеличению активности ферментов глутатионовой системы, а также росту содержания GSH. Так активность ГП и ГР, выраженная в виде Е/мл сыворотки, возрастала в 1,45 и 1,26 раза, соответственно (рис. 1). Активация антиоксидантных ферментов, при проводимой терапии, свидетельствует об усилении защиты клеток. При этом, содержание глутатиона возрастало в 1,37 раза (р<0,05) по сравнению с данными при патологии (рис. 2А). Вероятно, нормализация уровня глюкозы способствовала снижению интенсивности генерации АФК и, в том числе, уменьшению расходования НАДФН, необходимого для регенерации данного тиола. Кроме того, усиление активности ГП/ГР-системы также способствовало росту содержания GSH. Наблюдаемый эффект может также быть обусловлен снижением АФК под действием липоевой кислоты, которая может непосредственно нейтрализовать радикалы как в гидрофобной, так и в гидрофильной среде. Известно также, что липоевая кислота способна активировать сигнальный путь Nrf2/ARE, что будет способствовать увеличению уровня ГР и как следствие росту концентрации GSH [10].

На фоне этого происходило возрастание активности ГТ. Активность данного фермента, выраженная в виде Е/мл сыворотки крови, увеличивалась в 1,45 раза (р<0,05) (рис. 2Б). Снижение интенсивности свободнорадикальных процессов при проведении базисной терапии, могло способствовать восстановлению активности фермента. Росту активности также способствовало увеличение доступности восстановленного глутатиона.

Анализ корреляционных связей показал, что для больных ДН, проходивших стандартное лечение, была характерна положительная взаимосвязь между параметрами гликемии, биохимическими показателями крови, и уровнем антиоксидантов (табл. 3). В частности, уровень глюкозы натощак и ПгТТ коррелировали с активностью АсАТ (р<0,001), амилазы (р<0,01), концентрацией билирубина (р<0,01) и мочевины (р<0,01). Активность ГП коррелировала с уровнем глюкозы натощак (р<0,05), холестерином (р=0,002) и концентрацией GSH (р<0,05). При этом была выявлена отрицательная корреляция между активностью ГТ, концентрацией глюкозы через 2 ч после ПГТТ (р<0,05) и активностью АлАТ (р<0,05) (табл. 3).

Таблица 3. Взаимосвязь клинико-биохимических показателей в сыворотке
крови и уровнем исследуемых антиоксидантов у пациентов с диабетической нейропатией, получавших стандартное лечение.

Переменная	Корреляция, r (Пирсона )	р
Концентрация глюкозы натощак	АсАТ, r=0,438 Билирубин, r=0,306 Мочевина, r=0,357 Амилаза, r=0,364	<0,001 0,009 0,003 0,002
Концентрация глюкозы через 2 ч после ПГТТ	АсАТ, r=0,411 Билирубин, r=0,323 Мочевина, r=0,333 Амилаза, r=0,317	<0,001 0,006 0,005 0,007
Активность ГП	Глюкоза натощак, r=0,420 Холестерин, r=0,518 GSH, r=0,440	0,017 0,002 0,024
Активность ГТ	Концентрация глюкозы через 2 ч после ПГТТ, r=-0,339 АсАТ, r=-0,444	0,046 0,009
GSH	Глюкоза натощак, r=0,372	0,047

 

Полученные данные подчёркивают системное влияние концентрации глюкозы на показатели неврологического статуса больных ДН, а также свидетельствуют о наличии стойкой взаимосвязи между степенью нарушения метаболических процессов и выраженностью неврологического дефицита в условиях гипергликемии. Выявленная положительная корреляция между уровнем глюкозы, активностью ГП и содержанием GSH подтверждает ведущую роль гликемии в изменении антиоксидантного статуса.

Выводы. Таким образом, в ходе исследования было установлено, что проводимая терапия способствует изменению метаболизма углеводов и биохимических показателей крови в сторону контрольных значений. При этом, также наблюдается повышение активности антиоксидантных ферментов – ГП, ГР, ГТ и концентрации GSH, что свидетельствует об усилении защитного потенциала организма. Проведенный корреляционный анализ свидетельствует о наличие тесной взаимосвязи между биохимическими параметрами крови и компонентами глутатионовой антиоксидантной системы при ДН.

About the authors

Irina A Obraztsova

ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко

Author for correspondence.
Email: obraztsova311@mail.ru

 аспирант каф.поликлинической терапии ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России

Russian Federation

Sergey S Popov

ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России

Email: popov-endo@mail.ru

д.м.н., доцент, зав. каф. организации фармацевтического дела, клинической фармации и фармакогнозии ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко 

Russian Federation

alexey N Verevkin

ФГБОУ ВО ВГУ

Email: wer.all@mail.ru

к.б.н., доцент каф.медицинской биохимии, молекулярной и клеточной биологии ФГБОУ ВО ВГУ,

Russian Federation

Anna A Pashkova

ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России

Email: zuikova-therapia@vrngmu.ru

д.м.н., профессор, зав.каф.поликлинической терапии ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко 

Russian Federation

Evgeniy D Krylsky

ФГБОУ ВО ВГУ

Email: evgenij.krylsky@yandex.ru

к.б.н., доцент каф. медицинской биохимии, молекулярной и клеточной биологии ФГБОУ ВО ВГУ,

Russian Federation

References