SPECTROPHOTO AND DIGITAL COLORIMETRIC DETERMINATION INDICATOR OF BETA-ADRENOREACTIVITY OF ERYTHROCYTE MEMBRANES OF PATIENTS WITH BRONCHIAL ASTHMA

Full Text

Актуальность. Изменение жизненной функции организма нередко зависит от состояния эритроцитов и отражается на их качественной и функциональной характеристиках, что свидетельствует о возможном существовании глубокой двухсторонней связи между морфологическими изменениями эритроцитов и состоянием организма [11].

Определено, что имеется однонаправленность изменений адренореактивных свойств мембранных и клеточных структур под действием катехоламинов, включая мембраны эритроцитов. Данные обстоятельства послужили основанием считать бета-адренореактивность мембраны эритроцитов (β-АРМ) системным показателем адренореактивности организма, а изучение адренорецепции клеточных мембран - инструментом для исследования глубинных механизмов молекулярной патологии на ранней фазе патогенеза [4]. Среди факторов, влияющих на чувствительность бета - адренорецепторов эритроцита, выделяют напряжение кислорода, антигенные свойства эритроцита, степень активности симпато-адреналовой системы [9].

Для оценки бета-адренореактивности мембран эритроцитов отечественными учеными была разработана методика определения показателя β-APM [8]. Сущность метода заключается в количественной оценке степени ингибирования гипоосмотического гемолиза эритроцитов in vitro в присутствии бета-блокатора (пропранолол). При снижении активности симпато-адреналовой системы, адренореактивность увеличивается, рецепторы клеточных мембран эритроцитов связываются с бета-адреноблокатором, гипоосмотический гемолиз эритроцитов уменьшается, поэтому значения β-APM будут небольшими - от 2 до 16 единиц [8].

При увеличении активности симпато-адреналовой системы, циркуляции в крови ее медиаторов и, следовательно, десенситизации рецепторов клеточных мембран эритроцитов, адренореактивность организма снижается. При проведении пробы рецепторы клеточных мембран эритроцитов недостаточно связываются с бета-адреноблокатором, гипоосмотический гемолиз эритроцитов увеличивается и значения показателя β-APM количественно возрастают.

Показатель β-APM используется для прогноза индивидуальной стрессоустойчивости к экстремальным факторам профессиональной деятельности, например, у работников локомотивных бригад и диспетчеров железнодорожного транспорта при артериальной гипертензии [5]. Скрининг с применением показателя β-APM актуален для летного состава современной авиации с целью раннего выявления дисфункции сердечно-сосудистой системы [2].

Информативность применения метода определения показателя бета-адренореактивности мембран эритроцитов показана в исследовании у пациентов в остром периоде инсульта [3]. Установлена связь адренореактивности и стадией хронической сердечной недостаточности у пациентов, перенесших инфаркт миокарда [1].

В современных условиях цифровизации медицины возникают возможности применения новых технических средств определения бета-адренореактивности мембран эритроцитов на основе ранее разработанного метода.

В качестве альтернативы спектрофотометрическому анализу может быть предложен цветометрический подход, позволяющий использовать для получения аналитического сигнала не специализированные, а обычные бытовые приборы, регистрирующие изображения в цифровом формате [6]. Для обработки полученного изображения окрашенных образцов можно использовать стандартное программное обеспечение, позволяющее работать с цифровыми изображениями и оценивать цветность анализируемых изображений количественно, а также программы статистической обработки массивов данных [7]. Как правило, для построения градуировочной зависимости цветности анализируемого образца от концентрации окрашенного компонента, используют одну из компонент цветности или их сумму.

В настоящее время для определения β-APM по стандартной методике, наряду с реактивами, необходимо техническое оснащение. Современные лаборатории часто используют автоматизированные системы, что исключает использование дополнительного оборудования (спектрофотометр). Актуальность настоящего исследования связана с оценкой возможности цветометрического определения показателя бета-адренореактивности мембран эритроцитов в реальной клинической практике в сравнении со спектрофотометрической методикой.

Цель исследования – сравнительная оценка возможности определения бета-адренореактивности мембран эритроцитов пациентов, страдающих бронхиальной астмой, на основе цветометрической и спектрофотометрической методик регистрации гемолиза эритроцитов

Материал и методы исследования. Для определения β-APM в образцах крови 13 пациентов пульмонологического отделения ЧУЗ «КБ «РЖД-Медицина» г. Воронеж», госпитализированных в 2022 г. с диагнозом «Бронхиальная астма, смешанная форма, ДН I», была использована спектрофотометрическая методика с использованием наборов реактивов «АГАТ-МЕД» (Россия). Для подготовки образца к анализу использовались: концентрат буфера (натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный – 17,9 г/л, натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный – 11,7 г/л, натрий хлористый – 106,3 г/л); Раствор адреноактивного вещества [1-(изопропиламино)-3-(1-нафталенил-окси)-2-пропанола гидрохлорид] 7,5 г/л; Антикоагулянт (этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты динатриевая соль – 0,5 моль/л, рН 7,4; Физиологический раствор (натрия хлорида 9,0 г/л).

К 0,2 мл цельной крови с коагулянтом добавляли 0,2 мл физиологического раствора и перемешивали, избегая пенообразования. В две центрифужные пробирки вносили по 2,5 мл буферного раствора, 0,1 мл раствора адренореактивного вещества, 0,05 мл образца крови (опытные пробы). В другие две центрифужные пробирки вносили по 2,5 мл буферного раствора, 0,1 мл воды дистиллированной, 0,05 мл образца крови (контрольные пробы), перемешивали без пенообразования. Инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Настаивание повторяли дважды. Затем центрифугирова 10 мин при 2000 об/мин. Надосадочный слой переносили в кювету двухлучевого сканирующего спектрофотометра Shimadzu UV-1800 и измеряли величину оптической плотности при длине волны 541,6 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использован физиологический раствор.

Величину β-APM рассчитывали по формуле:

где β-APM - величина показателя адренореактивности, усл. ед.;

Ео1 и Ео2 – оптические плотности опытных проб;

Ек1 и Ек2 – оптические плотности контрольных проб.

 

В связи с тем, что анализируемые образцы имели выраженную окраску, в качестве альтернативы спектрофотометрическому анализу в исследовании использован цветометрический подход. Для регистрации изображения анализируемых образцов использовали смартфон. Съемку проводили в специальном боксе, оснащенном встроенными галогеновыми лампами, позволяющем избежать боковых засветок и стандартизировать условия освещения. Цветность полученных изображений оценивали с помощью программы Photoshop в рамках цветовой модели RGB, предназначенной для компьютерной передачи цвета. Полученные значения RGB были использованы для количественных определений. Для построения градуировочной зависимости цветности анализируемого образца от концентрации окрашенного компонента использовали значение компоненты RGB для оценки цветности тех же образцов, для которых проводили фотометрирование.

Полученные результаты и их обсуждение. Определение β-АРМ по стандартной методике [8] с использованием спектрофотометра для измерения величины оптической плотности надосадочного слоя при длине волны 541,6 нм слоя проведено у 13 пациентов, средний возраст 52±12 лет, 7 женщин и 6 мужчин, которые были госпитализированы с ухудшением клинического течения бронхиальной астмы. Для оценки контроля над астмой всем пациентам проводился АСТ-тест, который показал низкие величины (5-10 баллов) у пациентов наблюдаемой группы, что указывает преимущественно на тяжелое течение заболевания. Оценка адренореактивности показала, что величина β-АРМ от 2 до 16 единиц, при которой прогнозируется достаточная чувствительность адренорецепторов, не была выявлена ни в одном случае. Напротив, величина β-АРМ от 20 до 40 единиц, которая расценивается как умеренное снижение адренореактивности, установлена у 4 пациентов (30,7%), а величина β-АРМ≥60 единиц, указывающая на значительное снижение адренореактивности, имелась у большинства госпитализированных пациентов (69,3 %).

Сопоставление полученных значений рассчитанного по цветометрическим измерениям параметра β-АРМ в сравнении со стандартной спетрофотометрической методикой показали хорошую сходимость результатов.

Таблица 1 – Результаты определения параметра β-АРМ с использованием цветометрического и спетрофотометрического метода

№ образца	β-АРМ, усл.ед		расхождение результатов %
	Цветометрия	спектрофотометрия
1	54,30	55,27	1,7
3	45,15	45,18	0,1
3	44,72	46,68	4,2
4	54,05	55,28	2,2
5	53,38	55,93	4,5
6	27,50	26,18	5,0
7	33,16	33,23	0,2
8	28,76	29,35	2,0
9	28,41	29,95	5,1
10	34,51	35,98	4,0
11	68,22	66,21	3,0
12	53,43	50,59	5,6
13	62,34	64,20	2,8

 

Расхождение результатов определения β-АРМ с использованием цветометрического и спетрофотометрического метода составило не более 5,6%, что указывает на возможность замены спектрофотометра на регистрацию изображения в цифровом формате с использованием программного обеспечения, позволяющего работать с цифровыми изображениями и оценивать цветность анализируемых изображений количественно.

Востребованность исследований, посвященных определению активности адренорецепторов, подтверждается данными, полученными в последние годы. В частности, определение активности β-адренорецепторов на клетках периферической крови у пациентов с бронхиальной астмой и сердечно-сосудистой патологией [10]. Новизна нового метода определения активности адренорецепторов включала применение радиолигандного связывания β-адренорецепторов на поверхности Т- лимфоцитов с последующим расчетом радиоактивного материала на γ-счетчике. Для измерения количества радиоактивного материала в каждой пробе требуется оборудование специализированной лаборатории, что ограничивает использование метода в клинической практике [10].

Предложенная цветометрическая методика позволяет получать сходимые со спектрофотометрическим методом результаты по определению бета-адренореактивности. При этом цветометрический подход является экономичным, не требует специализированного оборудования и высококвалифицированной подготовки персонала. Его вполне можно отнести с экспрессным тест-методам анализа, который можно использовать как в лабораторных, так и внелабораторных условиях, реализовать с помощью обычного смартфона или любого другого прибора, позволяющего получать цифровое изображение (фотоаппарат, видео- или веб-камера). Цвет в этой модели складывается из красной (R), зеленой (G) и голубой (B) компонент, что близко к физиологии восприятия цвета человеческим глазом. Значения этих компонент могут меняться в интервале от 0 до 255 (как было принято при разработке этой модели). Нулевые значения всех этих величин соответствуют черному цвету, белый цвет передается максимальными (255, 255, 255) значениями параметров RGB. Любой цвет, его оттенок и интенсивность может быть передан набором этих трех параметров. Компьютерное зрение позволяет не только отличить малейшие различия цвета, но и численно охарактеризовать цветность анализируемых объектов. Далее полученные значения RGB можно использовать для количественных определений.

Активный интерес к методике определения адренореактивности в реальной клинической практике делает перспективными внедрение современных средств цифровой обработки образцов биоматериалов.

Динамика показателя β-АРМ может быть востребована при оценке ответа организма на стрессовую ситуацию, для контроля индивидуального ответа на фармакотерапию, для прогнозирования исходов сердечно-сосудистых событий [4, 9].

Выводы. При определении β-АРМ с использованием цветометрического и спетрофотометрического метода доказана возможность замены спектрофотометра на регистрацию изображения в цифровом формате с использованием программного обеспечения, позволяющего работать с цифровыми изображениями и оценивать цветность анализируемых изображений количественно.

Экономичность анализа цветового изображения, который позволяет проводить количественную оценку степени ингибирования гипоосмотического гемолиза эритроцитов в присутствии бета-блокатора, имеет перспективу для внедрения в клиническую практику, поскольку используются наборы отечественных реактивов и доступная цифровая техника (смартфон).

Поиск персонализированных подходов к оценке индивидуального ответа на фармакотерапию бронхиальной астмы требует дальнейшей разработки методов оценки бета-адренореактивности на фоне проводимой фармакотерапии.

About the authors

Lyudmila V. Rudakova

ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава РФ

Author for correspondence.
Email: vodoley65@mail.ru
SPIN-code: 1142-3784

доктор химических наук, доцент, зав. кафедрой фармацевтической химии и фармацевтической технологии

Russian Federation

Galina A. Batishcheva

ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава РФ

Email: bat13@mail.ru
SPIN-code: 2285-1917

доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой клинической фармакологии

Russian Federation

Tatiana N. Nikitina

ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава РФ

Email: pharmchem.vgma@mail.ru
SPIN-code: 7048-5877

кандидат химических наук, доцент кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии

Russian Federation

Elena N. Vetrova

ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава РФ

Email: pharmchem.vgma@mail.ru
SPIN-code: 4409-1658

кандидат химических наук, доцент кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии

Russian Federation

References