THE FLUORESCENT IMMUNOCYTOCHEMICAL TECHNOLOGY IN THE DIAGNOSTICS OF PRECANCERAL DISEASES AND CANCER OF THE ORAL MUCOSA

Full Text

Актуальность. Проблема своевременной диагностики предраковых заболеваний слизистой оболочки рта (СОР), ее дифференциальной диагностики с ранними стадиями бессимптомного рака превращается из медицинской в социально-экономическую, требующую конкретных путей решения, что позволит избежать интервенционных методов исследования, уменьшить риск развития запущенных стадий рака и снизить смертность [1, 2, 3, 4]. По данным последних эпидемиологических исследований высокие значения отмечены при диагностике новообразований визуальных локализаций, так на поздних стадиях (III-IV) выявлены 62, 4%-69, 0% опухолей полости рта. Установлено, что «грубый» и стандартизованный показатели смертности от злокачественных новообразований челюстно-лицевой области (ЗНО ЧЛО) по Приволжскому Федеральному округу регистрируется несколько выше российских и составляет 9, 10 и 5, 62 на 100 000 населения [5, 6]. В этой связи становится очевидной актуальность внедрения в широкую стоматологическую практику современных эффективных неинвазивных и доступных методов диагностики новообразований СОР. Цитологический метод исследования в настоящее время широко применяется в диагностике опухолевых и предопухолевых заболеваний различных локализаций. Однако, используя только рутинное цитологическое исследование, возникают непреодолимые трудности при установлении гистогененеза отдельных опухолей, трактовке первично-множественных поражений, определения степени распространенности опухолевого процесса. Известно, что определение гистологической формы опухолей при использовании только цитологического метода оказывается возможным в 60-70% [7, 8]. Учитывая тот факт, что цитологический метод используется прежде всего, как первичное диагностическое исследование, результаты его во многом определяют дальнейшею лечебную тактику, в связи с чем возникает необходимости в применении новых уточняющих методов. В последние годы появились сведения об использовании молекулярных иммуноцитохимических (ИЦХ) способов диагностики пред- и онкологических заболеваний различной локализации, в том числе шейки матки, молочной железы, легкого, мочевого пузыря. Одной из разновидностей ИЦХ исследования является прямая флуоресцентная иммуноцитохимия (ФИЦХ). Данная технология позволяет локализовать и идентифицировать клеточные и тканевые антигены, основываясь на их связывании с конъюгированными с флуорохромом антителами и визуализировать распределение «мишени» в исследуемом материале. Меченые флуорохромами антитела взаимодействуют с антигеном и визуализируются в виде яркого свечения практически мгновенно, что позволяет использовать методику для экспресс-диагностики. Кроме того, данный метод позволяет обнаруживать немногочисленные опухолевые клетки и их скопления, не выявляемые с помощью традиционного цитологического исследования, снизить частоту гипо- и гипердиагностики опухолевого процесса [9, 10]. Имеющиеся данные об эффективности применения данной технологии послужили основанием для оценки возможности ее использования в стоматологии. Материал и методы исследования. На базе кафедры пропедевтической стоматологии Института стоматологии ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава и ГБУЗ НО «Нижегородский областной онкологический диспансер» обследовано 108 человек в возрасте от 29 до 69 лет, средний возраст больных составил 58, 3±1, 4 года. Работа основывалась на принципах доказательной медицины. Все исследуемые были стандартизированы по гендерным признакам, возрастным категориям, были разделены согласно нозологическим формам на 3 группы: в первую вошли 38 больных с плоскоклеточным раком СОР, во вторую - 40 пациентов с предраковой патологией (18 человек с диагнозом «лейкоплакия СОР», 22 - «красный плоский лишай СОР»). Контрольную группу составили 30 человек без патологии СОР. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинской декларацией (Хельсинки, Финляндия, 1964 г. ), пересмотренной в Эдинбурге (Шотландия) в 2000 г., одобрено Этическим комитетом ПИМУ. От каждого пациента получено информированное согласие. На лабораторном этапе проанализировано 294 образца биоматериала. Забор для цитологического исследования осуществлялся традиционным способом путем соскоба на предметное стекло. Для дополнительной ФИЦХ-диагностики проводился самостоятельный смыв из ротовой полости. Окраска цитологических препаратов выполнялась по методу Романовского, визуализация осуществлялась с применением микроскопа «Zeiss Primo Star» (Carl Zeiss, Германия), используемые увеличения х100-1000. При цитологическом исследовании оценивался клеточный состав препарата с оформлением морфологического заключения, а также рассчитывался индекс кератинизации (ИК) согласно формуле: ИК = (Число ороговевших клеток / общее число клеток)*100%. С целью изучения экспрессии маркеров пролиферации выполнено иммуноцитохимическое исследование методом прямой иммунофлуоресценции с использованием антител к белкам P53 (мышиные, моноклональные, клон Pab240), P16 (кроличьи, моноклональные, клон EP1551Y), Ki67 (мышиные, моноклональные, клон EPR3610); используемые флуорофоры Cy5, AlexaFluor488, Cy3 («Abcam», Великобритания). Были исследованы следующие показатели: уровни экспрессии белков Ki67, Р16, Р53, а также коэкспрессия Ki67/Р16 в клетках эпителия СОР. Сопоставление результатов традиционной цитологической и ФИЦХ- диагностики осуществлялось с данными гистологического исследования, являющимся «золотым» стандартом и определяли чувствительность метода. Это способность диагностического метода давать правильный результат, который определяется как доля истинно положительных результатов среди всех проведенных тестов. Биопсийный материал фиксировался в 10% растворе нейтрального формалина, передавался в лабораторию, где заливался в парафин, полученные срезы толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Визуализация проводилась с помощью микроскопа «Leica DM1000» (Leica, Германия), используемое увеличение х200. Анализ полученных результатов производился с помощью пакета прикладных программ STATISTICA версия 6. 0 (StatSoft, USA) и Microsoft Exel с использованием методов одномерной статистики. Полученные результаты и их обсуждение. Анализ цитологического материала, полученного от пациентов со злокачественными новообразованиями СОР традиционным способом в сопоставлении с результатами гистологического исследования, показал, что чувствительность методы составила 76, 3% (29 случаев). При этом в микроскопической картине преобладали раздельно лежащие клетки многослойного плоского эпителия с клеточной и ядерной атипией, а также наличием в цитоплазме признаков патологического ороговения. Рассчитанный ИК данной группы пациентов составил 92, 31%±5, 3 (р≤0, 05). Цитологическое исследование материала пациентов с предраковой патологией СОР позволило установить диагноз «лейкоплакия» в 14 случаев, чувствительность составила 77, 8%. В морфологической картине при микроскопии препаратов отмечались обширные поля клеток плоского эпителия с признаками гиперкератоза, единичные эпителиальные клетки с явлениями паракератоза; фон препаратов при этом был чистым. У пациентов с клиническим диагнозом «красный плоский лишай» цитологическая картина соответствовала гистологическому заключению в 16 случаев, чувствительность составила 72, 7 %. В препаратах в основном отмечались воспалительные элементы в различном процентном соотношении, а также единичные клетки или мелкие группы клеток многослойного плоского эпителия с признаками гиперкератоза и/или акантолиза. ИК для лейкоплакии составил 70, 87%±3, 27, для красного плоского лишая 52, 05%±1, 62 (при р≤0, 05). Цитологическое исследование материала пациентов контрольной группы не выявило отличительных особенностей от нормальной морфологической картины СОР, ИК составил 38, 8%±1, 2 (р≤0, 05). В результате проведенного ФИЦХ исследования зарегистрирована более высокая экспрессия белков-маркеров в группе больных плоскоклеточным раком СОР, чем при предраковых процессах. Уровень экспрессии белка Ki67 составил 6, 800%±0, 002; Р16 - 4, 120%±0, 001; Р53 - 5, 060%±0, 001 (р≤0, 05). При этом у больных первой группы обнаружена коэкспрессия белков Кi67 и Р16 в эпителиальных клетках СОР (рис. 4), что, по-нашему мнению, может служить дополнительным критерием оценки и прогноза заболевания. В группе больных с предраковой патологией СОР показатели пролиферативной активности эпителия были статистически ниже, чем у больных раком СОР. Так, значения экспрессии Ki67 составили 2, 060%±0, 001; Р16 - 2, 630%±0, 001; Р53 - 0, 260%±0, 001 (р≤0, 05). Оценка экспрессии белков Ki67, Р16 и Р53 показала отчетливые различия между группами пациентов с раком СОР и предраковыми заболеваниями, при этом в контрольной группе пациентов экспрессии исследуемых маркеров обнаружено не было. Обращает на себя внимание тот факт, что чувствительность традиционного цитологического исследования в среднем составила 75, 9%, при этом проведение дополнительного ФИЦХИ позволило повысить чувствительность первичной морфологической диагностики до 97, 9%. Выводы. Проведение прямой флуоресцентной иммуноцитохимии на этапе донозологической диагностики в стоматологии для дифференциального микроскопического определения пред- и онкологической патологии слизистой оболочки рта позволило выявить различия в экспрессии маркеров пролиферативной активности в эпителии ротовой полости, что представляет собой перспективную стратегию, направленную на раннее активное выявление процессов малигнизации и снижение частоты развития плоскоклеточного рака органов и тканей полости рта.

About the authors

A. E. Pursanova

National Research Ogarev Mordovia State University

L. N. Kazarina

Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "Privolzhsky Research Medical University"

I. A. Kruglova

National Research Ogarev Mordovia State University

S. V. Zinovev

National Research Ogarev Mordovia State University

O. V. Utkin

FBUN NNIIEM them. Academician I. N. Blokhina Rospotrebnadzor

O. V. Kopylova

National Research Ogarev Mordovia State University

References