DETERMINATION OF CEFAZOLINE IN LIQUID MEDIA BY MODIFIED PIEZOELECTRIC SENSORS

Full Text

Актуальность. В настоящее время антибиотики занимают ведущее место в медицине при лечении различных инфекционно-воспалительных заболеваний [1], а также в пищевой промышленности для увеличения сроков хранения продуктов, поскольку способны подавлять микроорганизмы [2], в сельском хозяйстве для сохранности кормов [3], в животноводстве и ветеринарии [4; 5]. Однако бесконтрольное использование антибиотиков в качестве лечебных и профилактических средств, а также ошибки с назначением или дозировкой при лечении крупного рогатого скота могут привести к тому, что получаемые продукты животного происхождения (молоко, мясо) нередко содержат остаточные количества этих препаратов [3; 4]. Вместе с такими продуктами питания антибиотики могут попадать в организм человека оказывая отрицательное влияние на здоровье: подавляется активность ферментов, изменяется микрофлора организма, распространяются устойчивые виды бактерий, возникают аллергические реакции, дисбактериоз, мутагенность, токсичность и т.д. [1; 2; 4]. Формирование антибиотикорезистентности у патогенных бактерий сегодня рассматривается учеными как один из наиболее значимых рисков для здоровья человека [4; 5]. Контроль содержания остаточных количеств антибиотиков в пищевой продукции одна из важнейших составляющих мер по обеспечению безопасности пищевой продукции в отношении загрязненности ее антимикробными препаратами [4]. Поэтому, определение остаточных количеств антибиотиков является актуальной задачей современной аналитической химии, ветеринарии, фармацевтической и пищевой промышленностей [1]. В настоящее время для определения антибиотиков в продуктах питания широкое распространение получили несколько методов. Среди них ключевое место занимают хроматографические (ВЭЖХ, бумажная и тонкослойная хроматография) и спектральные методы анализа (атомно-адсорбционная спектроскопия, колориметрический метод, спектрофотометрия, ИК- и флюоресцентная спектроскопии) [6-9]. Также используются микробиологические и иммунологические методы анализа [10; 11]. Применяются также инструментальные экспресс-методы для определения антибиотиков [12]. Высокая стоимость оборудования и расходных материалов ограничивают широкое применение этих методов на производстве. Таким образом, перспективным является разработка экспресс-методов анализа с использованием портативных устройств, для анализа образцов во внелабораторных условиях. Такие методы позволяют непосредственно в «полевых» условиях выявить наличие тех или иных антибиотиков в продуктах питания. Одними из перспективных направлений является использование пьезоэлектрических сенсоров. Однако для создания селективных сенсоров, способных в многокомпонентных смесях обнаруживать и определять целевое вещество, необходимо поверхность их электродов модифицировать подходящим материалом. Как было установлено ранее [13-15] для модификации пьезоэлектрических сенсоров могут быть использованы полимеры с молекулярными отпечатками (ПМО) на основе полиимидов. Целью работы является разработка пьезоэлектрических сенсоров на основе полимеров с молекулярными отпечатками антибиотика цефазолина для его определения в жидких средах. Материал и методы исследования. В качестве объекта исследования был выбран цефазолин. Это антибиотик первого поколения цефалоспоринового ряда, представляет собой натриевую соль 3-[(5-метил 1,3,4-тиадизол-2-ил)тиометил]-7-[2-(1 Н-тетразол-1-ил) ацетамидо]-3-цефем- 4-карбоновой кислоты (рис. 1) с молекулярной массой 476,3 [16]. Рис. 1. Структурная формула цефазолина [16] Цефазолин - белый порошок, очень гигроскопичен. В виде кристаллического порошка стабилен при комнатной температуре в течение 2 лет, в растворах при температуре 4°С полностью сохраняет активность в течение 4 суток. Характеризуется широким спектром антимикробного действия. По механизму действия цефазолин аналогичен другим β-лактамным антибиотикам, является ингибитором синтеза клеточной стенки. Антибиотик хорошо растворим в воде. Практически не растворим в хлороформе, бензоле и диэтиловом эфире. Слабо растворим в метиловом спирте, растворим в диметилформамиде и пиридине. Температура плавления - 200° С [16 - 18]. Методика определения. Для определения антибиотиков использовали оригинальную установку разработанную на кафедре аналитической химии Воронежского государственного университета (рис. 2.), включающий акустический сенсор, генератор и систему сбора и передачи аналитических сигналов, частотомер АКТАКОМ-АСН-8322, подключенный к компьютеру [14]. При выполнении эксперимента использовались пьезоэлектрические кварцевые резонаторы АТ-среза с серебряными электродами диаметром 5 мм и толщиной 0,3 мм (производство ОАО «Пьезокварц», Москва) с номинальной резонансной частотой 4,00 МГц. Такой вид сенсоров позволяют проводить измерения в широком интервале температур благодаря низкому температурному коэффициенту. Рис. 2. Установка для определения веществ в жидкостях пьезокварцевым сенсором [19] Поскольку пьезокварцевые сенсоры не обладают селективностью, поэтому поверхность их электродов модифицировали полимерами с молекулярными отпечатками (ПМО) [20, 21]. Синтез ПМО проводили на основе сополимера 1,2,4,5-бензолтетракарбоновой кислоты и 4,4′-диаминодифенилоксида производства ОАО МИПП НПО «Пластик», г. Москва. Для этого готовили полимеризационную смесь, содержащую сополимер и раствор антибиотика в дистиллированной воде в N, N-диметилформамиде (ДМФА) в соотношении 1:2. Методом штампования смесь наносили на поверхность электрода сенсора [21]. Проводили термоимидизацию в сушильном шкафу в два этапа при температуре 80о С и затем при 180° С. После чего сенсоры охлаждали до комнатной температуры и помещали на 24 часа в дистиллированную воду для удаления шаблона. Остаточное содержание шаблона в полимере составляет не более 5 %. Таким образом, был получен сенсор ПМО-цефазолина. Оценку надежности полученных экспериментальных данных проводили методом математической статистики для малых выборок [22]. Определение антибиотиков в жидких средах проводили относительно холостой пробы, в качестве которой использовали дистиллированную воду. Методика измерения включает в себя несколько этапов. В начале частотомером регистрировали показания сенсора с холостой пробой (f1). Для этого на поверхность электрода сенсора наносили 1 мкл дистиллированной воды и регистрировали сигнал сенсора. После записи показаний удаляли холостую пробу, наносили 1 мкл анализируемого раствора, и записывали сигнал (f2). Относительный сдвиг частоты ∆f вычисляли по уравнению: ∆f = f1 - f2 где f1 - частота колебаний сенсора с холостой пробой, Гц; f2 - частота колебаний сенсора с анализируемым раствором, Гц. Способность пьезоэлектрических сенсоров на основе ПМО-цефазолин распознавать молекулу-темплат оценивали с помощью импринтинг-фактора (IF) , где DfПМО - разностная частота колебаний сенсора на основе ПМО, DfПС - разностная частота колебаний сенсора, модифицированного полимером сравнения. Коэффициент селективности (k) показывает способность сенсора определять целевую молекулу в присутствии других антибиотиков: , где * - разностная частота колебаний ПМО-сенсора при контакте с посторонним антибиотиком, - разностная частота колебаний ПМО-сенсора при контакте с определяемым антибиотиком. Исходные стандартные растворы антибиотиков, квалификации «фармакопейные» производства ПАО «Биосинтез», готовили по навеске, взятой на аналитических весах, а затем методом последовательного разбавления получили серию растворов в диапазоне концентраций 0,1 - 1,0·10-7 г/дм3. Для увеличения срока эксплуатации сенсора после серии измерений устройство промывалось дистиллированной водой и помещалось в сушильный шкаф на 60 минут при 50° С. Полученные результаты и их обсуждение. Поскольку модификацию пьезоэлектрических сенсоров полимерами с молекулярными отпечатками проводили непосредственно на поверхности их электродов с последующим удалением шаблона (темплата) без разрушения полимера, то в этом случае полученные отпечатки, полости, поры не подвержены деформации и комплементарны молекулам шаблона. Для определения концентрации антибиотиков в модельных растворах использовали метод градировочного графика. Установлено, что с увеличением концентрации аналита в растворе происходит уменьшение аналитического сигнала модифицированного пьезосенсора. При этом наблюдается линейная градировочная зависимость с коэффициентом детерминации R2 > 0,99 (рис. 3). Рис. 3. Зависимость разностной частоты сенсора ПМО-Цефазолин от концентрации в растворе Метрологические характеристики определения антибиотиков сенсорами на основе ПМО приведены в табл. 1. Таблица 1 - Метрологические характеристики определения цефазолина сенсорами на основе ПМО Сенсор Определяемый антибиотик Диапазон определяемых концентраций, г/дм3 Сmin, г/дм3 ПМО-цефазолина Цефазолин 0,1 - 0,1·10-4 1,0·10-5 На основании экспериментальных данных установлено, что предел обнаружения антибиотика составляет для цефазолина - 1,0·10-5 г/дм3, а диапазон определяемых концентраций антибиотиков - 0,1 - 0,1·10-4 г/дм3. Правильность определения цефазолина в модельных растворах и в молоке с помощью модифицированого пьезосенсора проверена методом «введено - найдено» (Табл. 2). Установлено, что относительное стандартное отклонение проведенного сравнения концентраций приготовленных модельных растворов и установленных сенсорами на основе МИП составляет не более 10%. Импринтинг-фактор для ПМО-цефазолин составляет 61,6. Коэффициент селективности рассчитывали по отношению к цефотаксиму для ПМО-ЦН равен 0,052. Таким образом, сенсор избирателен только к целевым молекулам-темплатам и не чувствителен к постороннему антибиотику. Таблица 2 - Определение антибиотиков сенсором ПМО-Цефазолин в жидких средах методом «введено-найдено» Анализируемые вещества С, г/дм3 Sr, % Введено Найдено Цефазолин 0,10 0,101±0,005 4,1 0,010 0,010±0,001 8,2 0,01 * 0,0113±0,0003 6,3 Цефотаксим 0,01 1,15·10-6±1,02·10-7 - 0,001 2,16·10-7±3,0·10-9 - Молоко «Домик в деревне», 3,2% - 2,8·10-7±3,0·10-9 - Молоко фермерское - 6,44·10-8±1,30·10-10 - Примечание: * Концентрация установлена спектрофотометрически Таким образом, можно сделать вывод, что пьезоэлектрический сенсор на основе ПМО-Цефазолина позволяет определять целевой антибиотик в модельных растворах или в молоке. Выводы. В работе показана перспективность использования пьезоэлектрических сенсоров на основе полимеров с молекулярными отпечатками для определения антибиотика цефалоспоринового ряда - цефазолина в пищевых продуктах. Данным способом можно обнаружить концентрации антибиотиков в аналите в диапазоне концентраций 0,1 г/дм3 - 0,1·10-4. Пьезосенсоры на основе полимеров с молекулярными отпечатками являются высокоспецифичными к определению молекул темплата, могут использоваться многократно, причем в широких температурных интервалах.

About the authors

I. I Ivanova

A. A Shapovalova

A. N Zyablov

References