OCCURRENCE OF NUCLEAR ANOMALIES IN THE BUCCAL EPITHELIUM CELLS OF WOMEN WITH ORAL LICHEN PLANUS

Full Text

Актуальность. Ранняя диагностика заболеваний человека является важной задачей современной медицины. В связи с этим представляется актуальным поиск критериев ранней диагностики заболеваний, в том числе онкологических [7, 8, 16, 22, 23, 25, 26]. В настоящее время активно проводятся исследования по выявлению влияния патологических процессов на частоту встречаемости клеток с аномалиями ядра в буккальном эпителии человека [3, 11 - 26 и др.], т.к. он является своеобразным "зеркалом" состояния всего организма [2]. Ряд ученых указывают на возможность применения критерия "число клеток с генетическими аномалиями" в качестве маркера озлокачествления при ранней диагностике онкологических заболеваний, а также при выявлении онкогенных факторов [4, 8, 16 - 18, 20 - 26]. Так, например, все авторы отмечают повышенный уровень клеток с микроядрами у больных карциномой [17, 20, 23 - 26] и в предраковом состоянии [19, 22]. Причем доля клеток с микроядрами по мере приближения к области поражения увеличивается [26], а после операции отмечается снижение числа эпителиоцитов с микроядрами [19]. При доброкачественной опухоли также наблюдается высокая доля клеток с микроядрами [20]. Предшественником карциномы является красный плоский лишай ротовой полости - хроническое воспалительное иммунозависимое заболевание кожи и слизистых оболочек с характерным поражением слизистой оболочки рта, десен, языка [1], поэтому важно как можно раньше диагностировать данное заболевание. В общей структуре заболеваний слизистой оболочки рта на долю красного плоского лишая приходится от 17 до 35 %. Наиболее часто заболевание встречается у женщин в возрасте от 50 лет и старше [9]. Исследования выявили увеличение доли клеток с микроядрами у лиц, страдающих красным плоским лишаем, по сравнению с контролем [15]. Grover et al. [13] провели сравнение частот встречаемости микроядер у больных красным плоским лишаём, лейкоплакией и подслизистым фиброзом ротовой полости при разных способах окрашивания. При использовании всех типов красителей были найдены достоверные различия между контрольной и исследуемыми группами. Микроядерный тест буккальных эпителиоцитов может помочь при ранней диагностике красного плоского лишая. Выявив частоты встречаемости нарушений при данном заболевании и сравнив их с таковыми у здоровых людей, можно определить, при каких значениях велик риск развития красного плоского лишая. В связи с вышеизложенным целью настоящей работы является исследование влияния красного плоского лишая на частоту встречаемости аберраций в буккальном эпителии у женщин в возрасте 50 - 60 лет. Материал и методы исследования. Исследования проводилось на базе Воронежской областной стоматологической поликлиники. Проведен анализ встречаемости ядерных аберраций в клетках буккального эпителия у 10 женщин в возрасте от 50 до 60, больных красным плоским лишаем. В качестве контроля было выбрано 10 женщин этой же возрастной группы без данного заболевания. Сбор эпителия со слизистой оболочки ротовой полости больных красным плоским лишаем осуществлялся из очага поражения и выше линии смыкания зубов вне очага поражения стерильным шпателем (перед сбором эпителия шпатель был обработан спиртом). Изготовление препаратов и их анализ осуществляли по методике описанной в работе Калаева с соавт. [5]. Собранный материал наносили на обезжиренное предметное стекло, распределяя его так, чтобы получился равномерный слой. Образцы высушивали и окрашивали азур-эозином по Романовскому-Гимза в течение 20 минут. Анализ препаратов осуществляли на микроскопе Laboval-4 (Carl Zeiss, Jena). Было проанализировано 40 препаратов, на каждом подсчитано не менее 1000 клеток. Всего было проанализировано 45738 клеток. Согласно Сычевой [10], все нарушения, фиксируемые при просмотре препаратов, были классифицированы на цитогенетические показатели (микроядро, протрузия типа “язык”, протрузия типа “разбитое яйцо”); показатели деструкции ядра (перинуклеарная вакуоль, кариопикноз, кариорексис, кариолизис); показатели пролиферации (насечка) (рис. 1). Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ “Stadia”. Процедура группировки данных и их обработка изложены в работе Кулаичева [6]. Сравнивали частоты встречаемости буккальных эпителиоцитов с аномалиями у обследуемых лиц с использованием непараметрического Х-критерия Ван-дер-Вардена. Дисперсионный анализ осуществляли с использованием непараметрического метода Краскала-Уоллиса. Для выявления цитологических признаков, имеющих диагностическую ценность, использовали ROC-анализ по методу DeLong et al. (программа MedCalc 17.1). а) б) в) г) д) е) ж) з) Рис. 1. Клетки буккального эпителия женщин, больных красным плоским лишаем. Обозначения: а - клетка буккального эпителия с микроядром; б - клетка буккального эпителия с перинуклеарной вакуолью; в - клетка буккального эпителия с протрузией типа “язык”; г - клетка буккального эпителия с насечкой; д - клетка буккального эпителия с протрузией типа “разбитое яйцо”; е - клетка буккального эпителия с карипикнозом; ж - клетка буккального эпителия с кариолизисом; з - клетка буккального эпителия с кариорексисом. Окрашивание азур-эозином по Романовскому-Гимза. Увеличение: 40х1.5х10. Полученные результаты и их обсуждение. В ходе исследования буккального эпителия больных красным плоским лишаем отмечено изменение числа клеток с ядерными аберрациями по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Дисперсионный анализ позволил установить зависимость частоты встречаемости нарушений от наличия красного плоского лишая для признаков "общая частота встречаемости всех нарушений", "показатели деструкции ядра", "число клеток с микроядами". Для признаков "общая частота встречаемости всех нарушений", "число клеток с микроядами" выявлена зависимость встречаемости нарушений от места взятия пробы у больного (в очаге поражения и вне его (табл. 2)). Выявлено статистически достоверное (p < 0,05) увеличение числа клеток с патологиями у больных красным плоским лишаем по сравнению с контрольной выборкой (25,21 ± 0,95 ‰). В очаге поражения число клеток с нарушениями (28,1 ± 1,29 ‰) было выше по сравнению с участками буккального эпителия вне данной зоны (23,96 ± 0,69 ‰, различия с очагом поражения достоверны (P < 0,01)). Частота встречаемости микроядер, клеток с показателями деструкции ядра (кариопикноз, кариорексис) в буккальном эпителии из очага поражения была достоверно выше, чем в контрольной группе. Частота встречаемости таких показателей деструкции ядра как перинуклеарная вакуоль, кариолизис в опытной группе была достоверно ниже по сравнению с контролем. Таблица 1 Частота встречаемости (‰) нарушений в буккальных эпителиоцитах женщин, больных красным плоским лишаем, и в норме нарушения опыт контроль вне очага поражения зона поражения цитогенетические показатели микроядро 2,23±0,19 2,69±0,11 ** 1,97±0,28 протрузия типа “разбитое яйцо” 1,01±0,18 1,03±0,26 0,93±0,28 протрузия типа “язык” 0,53±0,19 0,83±0,11 0,98±0,26 показатели деструкции ядра перинуклеарная вакуоль 5,46±0,45 ** 5,88±0,45** 10,57±0,58 кариорексис 3,13±0,66 ***а 5,04 ±0,23*** 0,37±0,15 кариопикноз 6,45±0,42** 6,94±0,82 ** 3,34±0,51 кариолизис 0,09±0,09***а 0,65±0,11 2,49±0,32 показатель пролиферации ядра насечка 5,01 ± 0,26 5,06 ± 0,31 4,71 ± 0,31 общая частота встречаемости всех нарушений 23,96 ± 0,69*б 28,10 ± 1,29* 25,21±0,95 Обозначения: а -различия между частотой встречаемости нарушений в очаге поражения и вне очага достоверны (p < 0,05); б -различия между частотой встречаемости нарушений в очаге поражения и вне очага достоверны (p < 0,01); * - различия с контролем достоверны (p < 0,05); ** - различия с контролем достоверны (p < 0,01); *** - различия контролем достоверны (p < 0,001). Следует отметить, что количество клеток с деструкцией ядра отличалась от контроля у больных женщин и вне очаге поражения; для показателей "число клеток с микроядрами" и "общее число нарушений" - было выше только в очаге поражения. Более высокие значения частот встречаемости клеток с микроядрами в очаге поражения свидетельствуют о нарастании в нем генетической нестабильности, что отмечается рядом автором при предраковых состояниях [16 - 18 и др.] и может способствовать озлокачествлению находящихся в очаге клеток. Таблица 2 Результаты дисперсионного анализа частоты встречаемости клеток с ядерными аномалиями в клетках буккального эпителия больных красным плоским лишаем Нарушение Способ анализа данных Без учета данных вне очага поражения С учетом данных вне очага поражения цитогенетические показатели микроядро - Влияние фактора достоверно* протрузия типа “разбитое яйцо” - - протрузия типа “язык” - - показатели деструкции ядра перинуклеарная вакуоль Влияние фактора достоверно** ⃰ Влияние фактора достоверно ** кариорексис Влияние фактора достоверно** Влияние фактора достоверно** кариопикноз Влияние фактора достоверно** Влияние фактора достоверно** кариолизис Влияние фактора достоверно** Влияние фактора достоверно** показатель пролиферации насечка - - общая частота встречаемости всех нарушений Влияние фактора достоверно* Влияние фактора достоверно* Обозначения: * - влияние фактора достоверно (P<0,05); ** - влияние фактора достоверно (P<0,001). Изменение числа клеток с патологиями, обусловленными деструкцией ядра, как в очаге поражения, так и вне его свидетельствует о генерализованности воздействия заболевания, вызывающего ядерные аберрации в клетках во всей ротовой полости. Достоверных различий между частотой встречаемости клеток с насечками (показатель пролиферации), а также клеток с протрузиями типа "язык" и "разбитое яйцо" в буккальном эпителии опытной и контрольной группах не было обнаружено. Таким образом, можно предложить использовать в качестве цитологических маркеров для постановки диагноза "красный плоский лишай" показатели деструкции ядра , число клеток с микроядрами и общее число клеток с нарушениями. Однако анализ 95 % доверительного интервала частот встречаемости изучаемых аномалий ядра у больных красным плоским лишаем в возрастной группе 50-60 лет (табл. 3) показывает его перекрывание с показателями в группе здоровых обследуемых, что затрудняет использование указанных цитологических критериев для постановки диагноза. Таблица 3 Цитогенетические нарушения (‰) в буккальном эпителии при красном плоском лишае и в норме для постановки диагноза нарушения опыт контроль вне очага поражения зона поражения цитогенетические показатели микроядро 1,65-2,75 2,15-3,33 1,65-2,33 протрузия типа “разбитое яйцо” 0,52-1,50 0,45-1,55 0,55-1,25 протрузия типа “язык” 0,02-1,02 0,25-1,45 0,62-1,33 показатели деструкции ядра перинуклеарная вакуоль 4,00-7,00 4,55-7-55 8,15-13,00 кариорексис 1,95-4,35 3,95-6,15 0,00-2,57 кариопикноз 5,00-8,00 0,00-2,55 1,25-5,85 кариолизис 0,00-1,95 0,00-2,00 0,00-4,55 показатель пролиферации ядра насечка 4,90-5,11 4,95-5,18 4,60-4,81 общая частота встречаемости всех нарушений 22, 96-25,00 27,96-29,55 23,96-27,86 Для преодоления данной методической трудности мы воспользовались ROC-анализом. Он позволил оценить диагностическую ценность изученных цитогенетических признаков при постановке диагноза "красный плоский лишай". Было установлено, что для образцов, отобранных в районе зоны смыкания зубов, ни один из исследованных признаков не имеет диагностической ценности (площадь под кривой составляет не более 0,5). Учет общего количества нарушений позволяет диагностировать патологию с чувствительностью 80 % и специфичностью 60 % при использовании в качестве точки отсечения значения 25,31 ‰. Для образцов, отобранных непосредственно в зоне поражения, наибольшую диагностическую ценность представляют показатели кариолизиса, кариорексиса, частоты встречаемости перинуклеарных вакуолей, кариопикноза (табл. 4, рис. 2). Таблица 4 Диагностическая ценность некоторых цитогенетических показателей для постановки диагноза "красный плоский лишай" Показатель Площадь под кривой Индекс Юдена Чувствительность, % Специфичность, % Точка отсечения кариолизис 1,000 1,000 100,0 100,0 0,92 кариорексис 1,000 1,000 100,0 100,0 1,06 перинуклеарная вакуоль 0,980 0,900 90,0 100,0 7,02 кариопикноз 0,905 0,900 90,0 100,0 5,95 Анализ полученных результатов позволил установить, что показатели частот встречаемости кариолизиса и кариорексиса в клетках тканей, пораженных красным плоским лишаем, имеют абсолютную диагностическую ценность: чувствительность и специфичность тестов составляет 100 %, что исключает получение как ложноотрицательных, так ложноположительных результатов (рис. 2а, 2б). а) б) Рис. 2. ROC-анализ показателей: а) "кариолизис", б) "кариорексис" для диагностики красного плоского лишая Для дополнительного подтверждения диагноза можно рекомендовать определение частот встречаемости перинуклеарных вакуолей и кариопикнозов (рис. 3). а) б) Рис. 3. ROC-анализ показателей: а) "перинуклеарная вакуоль", б) "кариопикноз" для диагностики красного плоского лишая Чувствительность данных тестов составляет 90 % при 100 %-ной специфичности, что снижает возможность гипердиагностики и практически исключает вероятность получения ложноотрицательных результатов. Таким образом для постановки диагноза "красный плоский лишай" у женщин в возрасте 50-60 лет, мы можем рекомендовать следующие значения частот встречаемости диагностически информативных аномалий ядра в клетках буккального эпителия из очага поражения (табл. 5). Таблица 5 Значения частот встречаемости прогностически информативных ядерных аномалий (‰) в клетках буккального эпителия женщин в возрасте 50-60 лет, рекомендуемые для постановки диагноза "красный плоский лишай" Аномалия ядра Больные Здоровые кариолизис <0,92 >0,92 кариорексис >1,06 <1,06 перинуклеарная вакуоль <7,02 >7,02 кариопикноз >5,95 <5,95 Выводы. Частота встречаемости таких нарушений, как клетки с микроядрами, кариорексисом, кариопикнозом, а также общее число клеток с аномалиями выше у женщин с красным плоским лишаем, а частоты встречаемости таких показателей деструкции ядра, как кариолизис и клетки с перинуклеарными вакуолями, - ниже. Повышение частоты встречаемости клеток с микроядрами в очаге поражения свидетельствует о нарастании генетической нестабильности, которая может способствовать их озлокачествлению клеток в зоне поражения. Возможно использовать ядерные аберрации, связанные с деструкцией ядра, в качестве маркеров при диагностике красного плоского лишая. Также возможно проведение анализа для выявления факторов, индуцирующих развитие данного заболевания, с использованием в качестве тестовых показателей ядерных аномалий. Частоты встречаемости кариолизиса и кариорексиса в клетках тканей, пораженных красным плоским лишаем, являются абсолютными предикторами красного плоского лишая. Для подтверждения диагноза можно рекомендовать определение частот встречаемости перинуклеарных вакуолей и кариопикнозов в клетках из зоны поражения.

About the authors

V. N Kalaev

Voronezh State University

A. Yu Vasilyeva

Voronezh State University

O. V Serikova

Voronezh State Medical University

B. R Shumilovich

Voronezh State Medical University

E. A Kalaeva

Voronezh State University

References