OPTIMIZATION OF TYROSINE DETERMINATION METHOD

Abstract


Through photocolorimetric research of tyrosine solutions of different concentrations CTyr = 0.2 ÷ 0.5 g /L was verified the possibility of determining the exact concentrations of the amino acid in aqueous solutions by constructing a calibration graph. The conditions of the study (pH of solutions, temperature, time) without the use of aqueous-organic media are clarified. Concentration restrictions for the analysis of tyrosine containing products (plant materials, pharmaceutical products, etc.) are determined.

Full Text

Актуальность. Разнообразие и спектр применение биологически активных добавок и современных лекарственных препаратов значительно расширяется с каждым годом, поэтому эффективный контроль их аминокислотного состава [1] - задача важная, требующая от научного сообщества повышенного внимания к усовершенствованию методик обнаружения и анализа этих веществ. Кроме того, количественные характеристики аминокислот в биологических жидкостях человеческого организма, например, в сыворотке, плазме крови или моче, позволяют судить о паталогических изменениях в работе некоторых органов [2-4]. Для идентификации большинства аминокислот в фармацевтической продукции выработаны ОФС (общая фармакопейная статья) с жестко регламентированными методами и отработанными методиками их анализа. Причем, приоритет при выборе метода анализа количественного состава аминокислот принадлежит фотометрическим методам [5, 6]. Объясняется это, вероятнее всего, такими преимуществами данных методов, как простота и скорость выполнения исследования, относительно низкая себестоимость анализа и широкий спектр возможных химических реакций при его реализации. В частности, для количественного определения аминокислот часто используют их реакцию с нингидрином, т.к. эта чувствительная реакция позволяет получить окрашенные, достаточно устойчивые или легко стабилизируемые комплексные соединения. Однако, данная реакция очень чувствительна к условиям ее проведения, что требует регулирования условий ее проведения для каждого конкретного случая (определения отдельных аминокислот или их смесей с варьируемым содержанием компонентов) [5]. Поэтому, оптимизация уже имеющихся методик анализа содержания аминокислот в различных системах является по-прежнему актуальной. Аминокислота тирозин (Tyr) является одной из 20-ти аминокислот необходимых человеческому организму для нормального функционирования. Tyr необходим для регулирования синтеза катехоламинов (дофамина), норадреналина, адреналина и других веществ, способных корректировать нейрофизиологические процессы (внимание, память, бдительность и т.д.), поэтому недостаток этих веществ вызывает у человека всевозможные когнитивные дисфункции [7-9]. И хотя Tyr не является незаменимой аминокислотой (синтезируется в организме из фенилаланина), у человека он не всегда содержится в достаточном количестве. Восполнить содержание этой аминокислоты возможно через богатые ею продукты питания, такие как всевозможные сорта сыра, куриное мясо, арахис, соевые и морепродукты, а также при помощи биологически активных добавок, тем более, что усваивается эта аминокислота лучше вместе с витамином С и витаминами группы В [7]. Количественно определять Tyr в различных субстанциях Фармакопея предлагает спектрофотометрически [10], тогда как колориметрические методы используются только в научных исследованиях аминокислотного состава образцов [11]. Преимущество последнего - доступность и меньшая затратность, поэтому было интересно проверить возможность фотоколориметрического определения Tyr в водных растворах при помощи нингидриновой реакции, а также определить условия проведения анализа и концентрационные границы исследуемых при этом растворов. Материал и методы исследования. Содержание Tyr в фармацевтических препаратах и продуктах питания варьируется в среднем в диапазоне 170 ÷ 2000 мг на 100 г продукта. Это соответствует интервалу концентраций раствора 0,2 ÷ 2 г/л (мг/мл), либо 0,02 ÷ 0,2 %. Очевидно, что основную долю фармацевтических продуктов или продуктов питания составляет органическая компонента, которая наиболее эффективно экстрагируется органическими растворителями. Tyr, как и большинство аминокислот, растворяется в воде, поэтому во избежание образования многокомпонентной смеси органических веществ в качестве растворителя выбрали H2O. Кроме того, это повышает долю определяемой аминокислоты (Tyr) в растворе, а работа с водными растворами наиболее безопасна и проста при постановке эксперимента. Следует отметить, что растворимость Tyr в воде ограничена, поэтому диапазон изучаемых концентраций был выбран СTyr = 0,2 ÷ 0,5 г/л, что соответствует ранее проводимым исследованиям растворов Tyr другими авторами [6, 11] или рекомендуемой ОФС концентрации для спектрофотометрического исследования водного раствора Tyr с реактивом Фолина-Чокальтеу (фосфомолибденовая кислота с фенолом) [10]. Исследование системы тирозин (Tyr) - нингидрин (NinH) - вода проводили фотоколориметрическим методом на приборе КФК-5М с использованием светофильтров для разных длин волн (λ) в диапазоне λ = 490-670 нм. Толщина кюветы (l) составляла 10,0 мм, в качестве раствора сравнения использовали воду. Калибровку и контроль правильности показаний прибора осуществляли согласно методике, описанной в инструкции по эксплуатации КФК-5М. Оптическую плотность исследуемых растворов (D) определяли с точностью D±0,002. Исходные растворы для исследований готовили из твердых веществ или концентрированных растворов на дистиллированной воде, очищенной от CO2. Исходные растворы тирозина (L-Tyr) (х.ч.) и нингидрина (х.ч.) готовили растворением точной навески вещества, отобранной на аналитических весах (m±0,0001). Растворы этих веществ для дальнейших исследований готовили методом последовательного разбавления исходных растворов. Системы для фотоколориметрического исследования Tyr - NinH - H2O готовили последовательным сливанием 5 мл раствора аминокислоты с концентрацией СTyr = 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; 0,5 г/л и избытка нингидрина (15 мл, СNinH=10 г/л). Приготовленную смесь нагревали до кипения и грели еще 2 мин, избегая интенсивного кипения, чтобы не происходило изменение общего объема системы за счет испарения воды. Анализируемый раствор, который приобретал интенсивную сине-фиолетовую окраску, исследовали фотоколориметрически. Для обработки экспериментальных данных использовали программу Microsoft Excel. Полученные результаты и их обсуждение. Колориметрическое исследование нингидриновой реакции в системе Tyr - NinH - H2O позволило получить зависимость интенсивности поглощения света продуктами этой реакции от длины волны излучения, т.е. используемого светофильтра (рис. 1). Рис. 1. Спектры поглощения продукта нингидриновой реакции в системе Tyr - NinH - H2O. D - оптическая плотность; λ - длина волны излучения; 1 - СTyr = 0,5 г/л; 2 - СTyr = 0,4 г/л; 3 - СTyr = 0,3 г/л Максимум поглощения вне зависимости от концентрации продукта нингидриновой реакции относится к длине волны 490 нм, поэтому дальнейшие исследования проводили с использованием данного светофильтра. Выполнение основного закона светопоглощения (закон Бугера-Ламберта-Бера) обеспечивает зависимость оптической плотности раствора от его концентрации. Если такая зависимость прямолинейна и проходит через начало координат, то в данных условиях часть светового спектра не поглощается растворителем и отсутствуют систематические погрешности, т.е. данный диапазон концентраций можно использовать для определения неизвестной концентрации вещества методом калибровочного графика. Таким образом, были получены зависимости изменения оптической плотности D продукта нингидриновой реакции с Tyr в водной среде согласно описанной выше методике. Диапазон изменения концентрации аминокислоты СTyr = 0,2 - 0,5 г/л в растворе с шагом изменения концентрации - 0,05. Ход всех полученных зависимостей был одинаков, а погрешность определения оптической плотности в каждой точке параллельных опытов не превышала 3,2%. Поэтому, для большей наглядности на рисунке 2 представлена одна зависимость, построенная по усредненным значениям оптической плотности 3-х параллельных опытов. Данные оптической плотности в зависимости от концентрации продукта нингидриновой реакции имеют полиноминальную зависимость, с явным отклонением от линейной зависимости в области низких концентраций. Следует отметить, что и погрешность в определении оптической плотности для растворов с СTyr = 0,2 и 0,25 г/л наиболее высокая и превышает 3%, тогда как для остальных концентраций эта величина составляет 1,5-2,8%. Рис. 2. Зависимость оптической плотности D продукта нингидриновой реакции с тирозином от концентрации тирозина, где СTyr = 0,2 - 0,5 г/л Таким образом, если рассматривать изменение оптической плотности нингидриновой реакции в диапазоне концентраций СTyr = 0,35 - 0,5 г/л (Рис. 3), то мы получим линейную зависимость, проходящую через ноль, что позволяет говорить о возможности использования данной области концентраций для фотометрического определения концентрации тирозина в водном растворе методом калибровочного графика. Рис. 3. Зависимость оптической плотности D продукта нингидриновой реакции с тирозином от концентрации тирозина, где СTyr = 0,35 - 0,5 г/л Изучение механизма нингидриновой реакции с различными аминокислотами [12] позволило установить, что максимальное значение оптической плотности продуктов нингидриновой реакции получается при соблюдении рН=5-6. Хотя данные исследования проводились в водно-органической среде и атмосфере азота, интересно было проверить влияние буферного раствора, стабилизирующего рН в данном диапазоне кислотности системы в условиях водной среды. Для этого был использован ацетатный буфер с рН=5,5. Оказалось, что при добавлении буферного раствора к исследуемой системе, стабильность окрашенных продуктов нингидриновой реакции значительно уменьшалась. После прохождения реакции при нагревании и появления фиолетовой окраски невозможно было получить воспроизводимые значения оптической плотности. Это связано с тем, что при более длительном выдерживании исследуемого раствора продукт нингидриновой реакции полностью разлагался: равномерное фиолетовое окрашивание исчезало с образованием красно-коричневой взвеси. Выводы. Полученные данные свидетельствуют о том, что возможность использовать нингидриновую реакцию в водном растворе для определения тирозина методом калибровочного графика, ограничена относительно небольшим диапазоном концентраций (0,35 - 0,5 г/л). Однако, предложенная методика позволяет определять содержание этой аминокислоты в исследуемых образцах (фармацевтической продукции, растительном сырье и др.) без использования токсичных растворителей и дорогостоящего оборудования. Кроме того, данная методика является не сложной в исполнении и не требует больших затрат времени.

About the authors

S M Vavilova

Voronezh State Medical University


A A Doroshenko

Voronezh State Medical University


N I Ponomareva

Voronezh State Medical University


E I Gavrikova

Voronezh State Medical University


References

  1. Копытко, Я. Ф. Аминокислоты и жирные кислоты настоек парнасия (белозора болотного) гомеопатических матричных / Я. Ф. Копытко // Химико-фармацевтический журнал. - 2003. - Т. 37, № 7. - С. 12-14.
  2. Разводовский, Ю. В. Влияние L-триптофана на содержание свободных аминокислот и биогенных аминов в головном мозге крыс при субхронической интоксикации фенобарбиталом / Ю. В. Разводовский, Е. М. Дорошенко // Химико-фармацевтический журнал. - 2003. - Т. 37, № 1. - С. 6-7.
  3. Рудаков, О. Б. Генотипическая изменчивость аминокислотного состава белков животного и растительного происхождения / О. Б. Рудаков, Л. В. Рудакова, М. С. Букша // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2020. - Т. 20, № 1. - С. 8-21.
  4. Определение двадцати протеиногенных аминокислот и добавок в культуральной жидкости методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / А. Д. Аскретков, А. А. Клишин, Д. И. Зыбин [и др.] // Журнал аналитической химии. - 2020. - Т. 75, № 8. - С. 721-729.
  5. Спектрофотометрическое определение концентрации L-лизина в водно-органических растворах / Ю. А. Нащекина, К. Е. Курдюкова, И. М. Зорин [и др.] // Журнал технической физики. - 2018. - Т. 88, вып. 9. - С. 1384-1386.
  6. Раздельное определение ароматических α-аминокислот и витаминов после экстракции из водных сред / Н. Я. Мокшина, Я. И. Коренман, О. А. Пахомова, А. В. Зыков // Аналитика и контроль. - 2009. - Т. 13, № 4. - С. 169-173.
  7. Огнев, С. И. Аминокислоты, пептиды и белки / С. И. Огнев. - Москва : Высшая школа, 2005. - 365 с.
  8. Проточно-инжекционное амперометрическое определение дофы и тирозина на двойном электроде, модифицированном бинарной системой золото-кобальт // Шайдарова Л.Г., Челнокова И.А., Лексина Ю.А., Ильина М.А., Гедмина А.В., Будников Г.К. // Журнал аналитической химии. 2018. Т. 73. № 2. С. 129-136.
  9. Племенков, В. В. Введение в химию природных соединений / В. В. Племенков. - Казань, 2001. - 376 с.
  10. Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Т. 3. - Москва, 2018. - URL: http://resource.rucml.ru/feml/pharmacopia/14_3/HTML/index.html. - Текст : электронный.
  11. Коренман, И. М. Фотометрический анализ: методы определения органических соединений / И. М. Коренман. - Москва : Книга по требованию, 2014. - 339 с.
  12. Определение иодтирозинов в пищевых продуктах // Куликовский А.В., Лисицын А.Б., Чернуха И.М., Горлов И.Ф., Савчук С.А. // Журнал аналитической химии. 2016. Т. 71. № 12. С. 1316-1320.

Statistics

Views

Abstract - 6

PDF (Russian) - 13

Article Metrics

Metrics Loading ...

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies