OXIDATIVE STRESS, APOPTOSIS AND THE SAME COMPONENTS OF IMMUNE SYSTEM DURING HYPOXIA

Full Text

Актуальность. Ведущим источником загрязнения атмосферного воздуха в городе Воронеж по данным статистики за 2012-2013 гг. являются выбросы автомобильного транспорта. Приоритетными загрязнениями атмосферного воздуха являются диоксид азота, взвешенные вещества, оксид углерода, диоксид серы [2]. Все эти факторы приводят к интенсификации процессов свободно-радикального окисления - оксидативного стресса, и как следствие, развитие разнообразных патологических состояний, например, печени, почек, а также сердечно-сосудистой, нервной [5], иммунной [4] и дыхательной систем [1]. Целью исследования является изучение отечественных и зарубежных источников литературы по данной теме, а также сопоставление взаимосвязи интенсивности оксидативного стресса, апоптоза и уровня ИЛ-6. Систематизация полученных данных позволит выработать рекомендации по применению маркеров апоптоза в качестве диагностики при гипоксии у больных ХОБЛ с гипертонической болезнью (ГБ). Полученные результаты и их обсуждение. При оксидативном стрессе увеличивается экспрессия генов цитокинов: фактора некроза опухоля-α (ФНО-α), интерлейкина (ИЛ)-6, ИЛ-1, ИЛ-8 и факторов транскрипции сJun (фактор транскрипции комплекса AP-1 (активаторный белок-1), NF kappa β (с английского Nuclear Transcription Factor-kappaB - ядерный фактор транскрипции - kappaB), также принимающих участие в развитии апоптоза [6]. Апоптоз играет значительную роль в гомеостазе целого организма, так как в различных тканях существуют определенные нормы по количеству клеток. Нарушение регуляции апоптоза приводит к возникновению различных заболеваний, связанных с усилением или, наоборот, торможением апоптоза. ФНО-α может индуцировать апоптоз как через активацию каспаз-3, так и через активацию каспазы-8 [6]. Каспазы (англ. caspase; англ. cysteine-dependent aspartate specific protease) - семейство цистеиновых протеаз, расщепляющих белки после аспартата. Каспазы играют важную роль в процессах апоптоза, некроза и воспалительных процессах. Каспаза-3 расщепляет ингибирующую субъединицу ICAD (ингибирующий комплекс для CAD), что приводит к освобождению CAD (с английского Сaspase-Аctivated DNase - ДНКаза, активированная каспазой), вызывая межнуклеосомное расщепление ДНК на ДНК-фрагменты по 180-200 пар нуклеотидов. Кроме того, происходит инактивация ферментов, вовлеченных в репарацию ДНК, в частности, фермента поли-АДФ-рибозополимеразы (PARP). Апоптозная гибель клетки сопровождается разрушением PARP каспазами. Было показано, что каспаза-3 инактивирует факторы трансляции eIF4F, 4EBP1, eIF2-α и поли(А)-связывающий белок (PABP) в клетках. Считается, что PABP-белок реагирует с кэп-инициаторным комплексом eIF4F и тем самым инициирует трансляцию. В результате первого цикла трансляции ядерные белки уходят с мРНК и поли(А) связывается через PABP с eIF4G, замыкая кольцо, что и активирует дальнейшую трансляцию. Нарушение в этом первом цикле приводит к быстрой деградации мРНК, начинающейся с отрезания кэпа. Согласно литературным данным, индукция апоптоза в различных типах клеток сопровождается быстрым падением общей эффективности синтеза белка. Предполагают, что ингибирование происходит, в основном, на стадии инициации трансляции. Считают, что после активации каспазы-3 начинается необратимая клеточная гибель. Каспазы активируют апоптоз двумя путями: цитозольным или рецепторным путем и митохондриальным [5]. Стрессорные воздействия, вызванные цитотоксическими соединениями, АФК и нарушениями структуры ДНК, приводят к образованию гигантской поры (мегаканала) в наружней мембране МТХ. Одним из видов мегаканала является неспецифический канал, образующийся при окислении SH-группы цистеина в аденозиннуклеотидтрансферазе. Вследствие раскрытия гигантской поры матрикс митохондрий набухает, наружняя мембрана митохондрий разрывается, в цитоплазму выходят белки межмембранного пространства. Среди таких белков несколько апоптозных факторов: AIF (с английского Apoptosis Inducing Factor - фактор, вызывающий апоптоз), цитохром C, прокаспазы-2, -3, -9, SMAC (с английского Second Mitochondria-Derived Activator Of Apoptosis - второй митохондриальный фактор, активирующий апоптоз), эндонуклеаза G, а также АФК, ионы Са2+ и Mg2+. Выход цитохрома С из митохондрий происходит на ранних стадиях апоптоза, уменьшается при действии Вс1-2 и увеличивается при действии Bax и каспазы-3 [5]. Процесс регулируемой клеточной гибели можно разделить на несколько фаз: инициация апоптоза (индукторная стадия), проведение сигнала, эффекторная стадия (активация каспаз, активация эндонуклеаз) и специфическая деградация ДНК. Конечным этапом апоптоза считают формирование апоптотических телец, захватываемых и деградируемых соседними клетками или макрофагами [5]. В отличие от некроза, при котором происходит разрыв клеток с освобождением их содержимого и развитием воспаления, при апоптозе не происходит увеличение провоспалительных цитокинов. Иммунологические процессы, связанные с апоптозом обусловлены взаимодействием рецептора Fas (CD95/APO-1) и его лиганда FasL, широко распространённых в клетках иммунной системы, в частности, Т- и NK-клетках [4]. Для выявления программированной клеточной гибели используется флуоресцентная микроскопия. Исследуют окрашенные клетки во взвеси и фиксированные препараты, учитывают следующие признаки: уменьшение размеры ядра, конденсацию и уплотнение хроматина, сохранность мембранной изолированности хроматиновых тел, характер свечения ДНК. На ряду с этим проводят оценку уровня экспрессии CD 95, CD 95L на лимфоцитах периферической крови и концентрацию их растворимых форм sCD 95, sCD 95L, а также ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-a, ФНО-ß, интерферона-γ, sAPO-1/FAS, TRAIL, Hsp27, супероксиддисмутазы, каспазы-1, -3, -8, -9 p53, NF kappa B, p38MARK и других маркеров в сыворотке крови или лизате клеток. Материал и методы исследования. Нами было проведено комплексное обследование пациентов, страдающих ХОБЛ с сопутствующей гипертонической болезнью, на базе НИИ экспериментальной биологии и медицины, кафедры патологической физиологии ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России, пульмонологического и кардиологического отделений городской клинической больницы №20 г. Воронежа. Для решения поставленных задач были обследованы 80 больных ХОБЛ II степени с сопутствующей ГБ II стадии, степень АГ I - II, риск IV, в возрасте от 41 до 70 лет (средний возраст 58,1±2,0 лет). Среди них было 50 мужчин и 30 женщин. Также были обследованы 20 условно-здоровых людей, средний возраст которых составил 48,9±0,7 лет - для определения нормальных значений исследуемых показателей (контрольная группа). Диагноз ХОБЛ и ГБ устанавливали согласно Международной классификации болезней 10 пересмотра (МКБ-10), подготовленной Всемирной Организацией Здравоохранения (Женева, 1992), а также в соответствии с федеральными клиническими рекомендациями по ХОБЛ и артериальной гипертензии. При отборе больных для исследования учитывали длительность заболевания, пол, возраст, наличие сопутствующей патологии. В работе использованы общеклинические и специальные методы исследования, оценивались показатели насыщения гемоглобина кислородом при проведении пульсоксиметрии с помощью портативного пульсоксиметра NIKSY MD 300C1, предназначенного для неинвазивного выборочного измерения функции насыщения кислородом гемоглобина артерий (SpO2). Интенсивность оксидативного стресса оценивалась с помощью определения уровня малонового диальдегида (МДА), окислительной модификации белка (ОМБ), активности супероксиддисмутазы (СОД) [7] и тиоловых групп (SH-групп) [3]. Уровень ИЛ-6 определяли согласно инструкции к готовому коммерческому набору для иммуноферментного анализа компании «Bender Medsystems», (Австрия). Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием стандартных методов вариационной статистики: расчета средних значений, стандартного отклонения, ошибки средних значений, t-критерия Стьюдента, программы Excel для построения графиков, пакета прикладных программ Statistica 6,0. Полученные результаты и их обсуждение. Проведённые нами исследования показали, что у больных ХОБЛ с ГБ наблюдается гипоксия и снижение насыщения гемоглобина кислородом до 93,10±0,85%, возникает дисбаланс в системе прооксиданты-антиоксиданты с преобладанием свободнорадикальных процессов, при этом возрастает уровень малонового диальдегида и провоспалительного цитокина ИЛ-6 в 1,25 и 1,54 раза, степени окислительной модификации белков в 1,44 раза, активность супероксиддисмутазы и содержания тиоловых групп снижается в 2,32 и 1,07 раза соответственно по сравнению с данными контрольной группы (рис.1). Рис.1. Уровень ИЛ-6 и показатели оксидативного стресса в контрольной группе (ряд 1) и у пациентов, страдающих ХОБЛ с ГБ (ряд 2). Выводы. Выявлено снижение уровня супероксиддисмутазы на 60% с одновременным повышением уровня малонового диальдегида в 1,25 раза, степени окислительной модификации белков в 1,44 раза и интерлейкина-6 в 1,54 раза при гипоксии у пациентов с ХОБЛ и ГБ, что свидетельствует об интенсификации свободнорадикального окисления и, вероятно, процесса апоптоза. Вместе с тем для оценки апоптотических процессов необходимо дальнейшее исследование с использованием флуоресцентной микроскопии и определения других маркеров апоптоза, например, ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-a, интерферона-γ, активности каспаз.

About the authors

L N Tsvetikova

Voronezh State Medical University

Email: tsvn@bk.ru

N V Lobeeva

Voronezh State Medical University

Y G Zhusina

Voronezh State Medical University

Email: amtidu@mail.ru

N B Labzhanija

Voronezh State Medical University

References