HISTOCHEMICAL AND GISTOTOPOGRAPHICAL FEATURES OF EXTRACELLULAR MATRIX COLLAGEN FIBERS OF CONNECTIVE TISSUE OF MICE C57 BLACK STOMACH AFTER SPACE FLIGHT

Full Text

Актуальность. Соединительная ткань вездесуща в организме млекопитающих и создает необходимые условия для реализации функциональной активности клеток различных органов. Особое значение элементы внутриорганной соединительной ткани начинают приобретать в условиях измененной гравитации, в том числе, в невесомости, поскольку выполняют функцию скелета (стромы). Ранее было показано, что по аналогии с опорно-двигательным аппаратом, в условиях микрогравитации интерстиций органов желудочно-кишечного тракта подвержен специфическим изменениям [2, 4, 24, 25]. Однако подобные исследования соединительной ткани системы пищеварения млекопитающих после пребывания в космическом полете были выполнены только на монгольских песчанках [2, 4, 24, 25]. Эксперимент на биологическом спутнике "БИОН-М" №1, полет которого продолжался с 19 апреля по 19 мая 2013 года, предоставил уникальные возможности для выявления последствий длительного пребывания в невесомости на организм млекопитающих, в том числе, на соединительную ткань. Помимо рекордной продолжительности полета, был выполнен эксперимент по 7-суточной реадаптации организма лабораторных животных после приземления биоспутника. В выполненной работе впервые проводится оценка длительного воздействия факторов космического полета на состояние волокнистого компонента внеклеточного матрикса соединительной ткани оболочек желудка млекопитающих, а также впервые изучены восстановительные процессы в интерстиции спустя 7 суток после возвращения к земной гравитации. Материал и методы исследования. При изучении биоматериала желудка мышей С57 black для оценки волокнистого компонента стромы использовались современные данные молекулярной биологии, рентгеноструктурного, гистологического и гистохимического анализов о строении соединительной ткани [13]. Эксперимент проведен на 58 самцах мышей С57 black (табл.1). В серию 30-суточного космического полета входили 5 животных, от которых биоматериал был взят через 9-11 часов после приземления биоспутника в Институте медико-биологических проблем РАН (г.Москва), а также 5 животных, которые после возвращения из орбитального полета 7 суток находились в условиях земной реадаптации. В серию моделирования влияния факторов космического полета в наземных условиях (биологический контроль) входили 16 животных, из которых одна половина находилась 30 суток в макете полетной аппаратуры "БИОС-МЛЖ", а другая после модельного эксперимента проходила 7-суточную реадаптацию. Каждой из четырех вышеперечисленных групп животных соответствовала группа мышей виварийного контроля в количестве 8 мышей (табл. 1). Исчерпывающая информация по условиям содержания, питания и другим особенностям программы полета биоспутника «БИОН-М1» представлена в обзорных статьях [17, 26]. После декапитации животных фрагменты фундального отдела желудка фиксировали в 10% нейтральном формалине при комнатной температуре и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 6 мкм, выполненные по длинной оси фрагментов желудка, окрашивали гематоксилином Карацци и эозином, железным гематоксилином Вейгерта и пикрофуксином с помощью метода ван Гизон, а также импрегнировали азотнокислым серебром по методу Фута для идентификации ретикулярных волокон [11, 12, 27, 31, 34]. Топографию, тинкториальные характеристики и содержание коллагеновых волокон в интерстиции желудка оценивали на стандартной площади. Для количественной оценки состояния волокнистого компонента интерстиция использовали планиметрический подход [1], в условных единицах определяя индекс содержания волокон. При получении репрезентативной выборки исследовалось не менее 50 полей зрения. Полученный информационный массив статистически обрабатывался с использованием компьютерной программы Stat Soft Statistica, 6.0. Для сравнения двух выборок применяли t-критерий Стьюдента с уровнем значимости p<0,05. При отсутствии нормального распределения данных достоверность отличий проверяли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона. Исследования проведены с соблюдением требований по гуманному обращению с животными в соответствии с решением Комиссии по биомедицинской этике ИМБП (протокол № 206 от 07.10.2007 г.). Полученные результаты и их обсуждение. Стенка желудка мышей С57 black виварийной группы имела типовую стратификацию и была представлена слизистой, подслизистой, мышечной и серозной оболочками. Слизистая оболочка дна желудка, покрытая призматическим железистым эпителием, содержала фундальные железы, между которыми обнаруживались свободно расположенные ретикулярные волокна. В слизистой оболочке была хорошо заметна мышечная пластинка, в которой локализовалась сеть тонких переплетающихся волокон с умеренной аргирофилией. В подслизистой основе обнаруживалось большее количество разнокалиберных ретикулярных волокон, расположенных рядом с пучками коллагеновых волокон. Высокое содержание ретикулярных волокон определялось в мышечной оболочке, в том числе, перимизии (рис. 1-А, 1-Б). Слои гладких миоцитов были разделены скоплениями рыхлой волокнистой соединительной ткани, содержащей ретикулярные волокна различной толщины. С плазмолеммой гладких миоцитов контактировали ретикулярные волокна, преимущественная ориентация которых была параллельна длинной оси гладких миоцитов. В серозной оболочке желудка ретикулярные волокна обладали умеренной аргирофилией. При исследовании волокон, представленных преимущественно коллагеном I типа, было выявлено, что в желудке мышей виварийной группы основным местом их локализации являлась подслизистая оболочка, в которой они формировали умеренно фуксинофильные разнокалиберные пучки. Наибольшее развитие коллагеновых волокнистых структур наблюдалось около артерий и вен подслизистой оболочки. После космического полета в сравнении с данными животных группы виварийного контроля становились очевидными процессы дезорганизации ретикулярных волокон и изменение их числа. В собственной пластинке слизистой оболочки желудка количество ретикулярных волокон возрастало. При этом на ее протяжении выявлялись локусы с высоким содержанием аргирофильных волокон либо зернистых структур. Иногда такие изменения затрагивали всю толщу слизистой оболочки. Довольно часто зоны с повышенным содержанием волокнистых структур формировались как в поверхностных слоях слизистой оболочки, так и в донных областях собственных желез желудка, свидетельствуя об определенных дистрофических нарушениях. Это сочеталось с повышением аргирофилии ретикулярных волокон интерстиция. Наоборот, в мышечной пластинке слизистой оболочки происходила достоверная редукция числа ретикулярных волокон. Топографические особенности, присущие животным из группы виварийного контроля, обнаруживались существенно реже. Аналогичные изменения выявлялись и в области подслизистой оболочки. Уменьшалось количество ретикулярных волокон крупного калибра, часто идентифицировался зернистый импрегнированный материал, или фрагменты волокон. В мышечной оболочке желудка обнаруживались наибольшие послеполетные изменения ретикулярных волокон. Количество импрегнированных волокнистых структур достоверно снижалось на протяжении мышечных пластов и в межмышечном интерстиции (табл. 1; рис. 1-Б, 1-В). Иногда в мышечной оболочке визуализировались локусы, в которых аргирофильные структуры практически не выявлялись (рис. 1-В). Изменялась гистотопография ретикулярных волокон. Значительно редуцировались аргирофильные волокна вокруг гладких миоцитов. Часто выявлялись локусы с накоплением зернистого аргирофильного материала. На протяжении ретикулярных волокон обнаруживалсиь изменения аргирофильных свойств, от микролокусов с низкой степенью окрашивания до высокой степени импрегнированности. Выявлялись конгломераты из окрашенного материала, которые преимущественно были вытянутой формы и крупных размеров. В подслизистой оболочке желудка наблюдалась редукция пучков коллагеновых волокон, отечные явления и существенное возрастание фуксинофилии волокнистых структур. Кроме того, выявлялись участки гомогенизации пучков коллагеновых волокон, среди которых некоторые характеризовались пикринофилией. Это указывало на дистрофические процессы, приводящие к изменению строения коллагеновых волокон, вплоть до дезорганизации в пределах микролокусов. После 7-суточной наземной реадаптации состояние ретикулярных волокон в слизистой оболочке не возвращалось к показателям групп виварийного и биологического контролей. Прежде всего, это касалось количественных критериев. В местах локализации клеток собственных желез желудка, подвергнутых наиболее выраженным дистрофическим изменениям в условиях космического полета, сохранялось повышенное содержание аргирофильных структур. Также наблюдалось высокое содержание сети ретикулярных волокон в прослойках соединительной ткани, разделяющей собственные железы желудка. Кроме того, нормализации тинкториальных свойств ретикулярных волокон не наблюдалось - у всех животных отмечалась повышенная аргирофилия волокнистых структур. В то же время, в мышечной пластинке слизистой оболочки и, особенно, в мышечной оболочке происходили существенные изменения состояния ретикулярных волокон. Прежде всего, их численность достоверно возрастала (табл. 1, рис. 1-Д, 1-Е). При этом восстанавливалась гистоархитектоника волокон по отношению к гладким миоцитам. Одновременно обращало на себя внимание высокое содержание импрегнированных фрагментов в мышечной оболочке. Восстанавливалось содержание ретикулярных волокон, контактирующих с базальной мембраной гладких миоцитов (рис. 1-Е). Численность локусов гладкой мускулатуры желудка с явлениями редукции сети ретикулярных волокон уменьшалась. При исследовании желудка после 30-суточного модельного эксперимента в макете полетной аппаратуры "БИОС-МЛЖ" и спустя 7 суток после его завершения основные изменения ретикулярных волокон происходили в слизистой оболочке. Прежде всего, изменялись тинкториальные характеристики ретикулярных волокон в виде снижения аргирофилии. Дистрофические изменения покровного эпителия и собственных желез желудка отмечались в пределах микролокусов. В мышечной пластинке слизистой оболочки топография волокнистых элементов практически не отличалась от картин, наблюдаемых в группе животных биологического контроля. Исследование ретикулярного остова подслизистой оболочки показало высокое содержание ретикулярных волокон, находящихся в тесном контакте с волокнистыми структурами, образованными коллагеном I типа. В мышечной оболочке обращала на себя внимание тенденция к возрастанию индекса содержания ретикулярных волокон по сравнению с показателями контрольной группы животных, не достигающая достоверного уровня. Главным образом, изменялись тинкториальные свойства ретикулярных волокон, что проявлялось снижением аргирофильных свойств. При исследовании материала животных, обследованных на 7-е сутки после проведения модельного эксперимента, выявленные микроскопические картины по большинству признаков не отличались от показателей животных группы биологического контроля. Исследование коллагеновых волокон в подслизистой оболочке показало, что условия модельного эксперимента вызывали преимущественно изменение тинкториальных характеристик пучков коллагеновых волокон. Приступая к обсуждению полученных результатов, следует заметить, что значение измененной гравитации в формировании морфологических эквивалентов адаптации к условиям космического полета различных органов является предметом многочисленных дискуссий [8, 9, 10, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 24, 25]. Полученные в выполненной работе результаты согласуются с проведенными гистохимическими исследованиями интерстиция органов пищеварительной системы монгольских песчанок, побывавших в условиях 12-суточного космического полета на КА «Фотон-М3» [2, 4, 22, 23]. Это свидетельствует о существовании гравитационной сенситивности соединительной ткани, прежде всего, волокнистого компонента межклеточного матрикса, что, в свою очередь, может определять специфику развития морфофункциональных изменений органов пищеварительной системы в условиях орбитального полета [2, 18, 20, 21, 24, 25]. Выявленные признаки адаптивного ремоделирования внеклеточного матрикса соединительной ткани желудка после космического полета в виде редукции волокнистого компонента стромы могут быть опосредованы снижением эффективности фибриллогенеза и нарушением процессов восстановления межклеточного вещества. С этим хорошо согласуются результаты эмбриологического эксперимента на орбитальной станции "Мир" с птенцами японского перепела [7]. Причинами формирования иной гистоархитектоники и тинкториальных свойств волокнистого компонента в условиях невесомости может быть комплекс факторов, в том числе, состояние кислотно-щелочного равновесия, ионный дисбаланс и аморфный компонент межклеточного вещества соединительной ткани. Фибриллогенез в условиях пониженной гравитации может приводить к изменениям калибра как отдельных ретикулярных волокон, так и площади организуемых ими сетей. Следует отметить также высокий потенциал элементов соединительной ткани к процессам реадаптации после возвращения животных из космического полета. Очевидно, что интерстиций органов пищеварительной системы подвергался структурно-функциональным перестройкам, отражающим как адаптивные, так и альтеративные гравитационно-индуцированные процессы. Не менее важное диагностическое значение имели признаки усиления взаимодействия использованных красителей с коллагенами, что может быть обусловлено высвобождением большого числа реакционноспособных групп из-за процессов деполимеризации волокнистых структур вследствие трофических нарушений либо биоэффектов галактической компоненты космического излучения на молекулярном уровне. Известно, что условия орбитального полета приводят к развитию гемодинамических изменений в органах брюшной полости, в том числе, в желудке [6]. Таким образом, в условиях невесомости формируются метаболические перестройки аморфного компонента интерстиция, связанные с изменением уровня рН, содержанием гиалуроновой кислоты, других гликозаминогликанов в тактоидах, воды и т.д.. Это может отражаться на интенсивности экстрацеллюлярной сборки волокон. Второй этап фибриллогенеза волокнистых коллагеновых белков происходит в экстрацеллюлярном пространстве с формированием протофибрилл, микрофибрилл, фибрилл и, наконец, волокон [13]. При этом, в начальной стадии самопроизвольного формирования волокнистой фазы интерстиция молекулы тропоколлагена образуют перицеллюлярные молекулярные скопления (мезофазы), в которых между молекулами имеется расстояние, заполненное жидкостью [13]. Для инициации начала процесса образования надмолекулярных агрегатов коллагена необходимо сближение молекул тропоколлагена до определенного расстояния, что требует уменьшения объема водной среды между ними, а также множество других условий, в том числе, концентрации тропоколлагена, осмотического давления, температуры, ионной силы, рН, количества протеогликанов, ионов-комплексообразователей, АТФ, аскорбиновой кислоты, ферментов и многих других факторов [13]. Можно предположить, что в условиях невесомости эти условия могут меняться, что и приводит к изменению процессов физиологической регенерации коллагеновых волокон. При этом, нельзя не отметить значение тучных клеток в формировании изменений состояния соединительной ткани, как регуляторов местного гомеостаза и дирижеров тканевых метаболических процессов как в норме, так и при патологии - воспалении, заживлении ран, ангиогенезе, онкогенезе и др. [29, 30, 32, 33]. Тем более что ранее были показаны существенные морфофункциональные перестройки в структуре популяции тучных клеток после космического полета (3, 5). Также, измененная гравитация может вызывать процессы дезорганизации коллагеновых волокон вследствие формирования определенных трофических нарушений и снятия статической нагрузки, имеющей место в условиях обычной земной гравитации. Таким образом, ускоренная редукция волокнистого остова в совокупности с отсутствием стимула к образованию коллагена приводили к уменьшению объема волокнистых структур в интерстиции желудка. Учитывая наиболее выраженные изменения волокнистого компонента межклеточного матрикса в мышечной оболочке желудка, можно предположить, что эти изменения могут оказывать влияние на снижение моторной функции желудочно-кишечного тракта, показанные в ряде функциональных исследований [18, 20, 25, 28]. Таблица 1. Индекс содержания ретикулярных волокон в мышечной оболочке желудка мышей С 57 black (в усл.ед.) Группы эксперимента Желудок Эксперимент на борту биологического спутника "БИОН-М" №1 Виварийный контроль к группе 30-суточного космического полета (n=8) 0,214±0,019 Группа космического полета, находившаяся в течение 30 суток в условиях невесомости (n=5) 0,154±0,011 *,** Группа реадаптации, обследованная спустя 7 суток после возвращения животных из 30-суточного космического полета (n=5) 0,244±0,017 *,** Виварийный контроль к группе 7-суточной реадаптации после 30-суточного космического полета (n=8) 0,202±0,012 Эксперимент в макете полетной аппаратуры "БИОС-МЛЖ" Виварийный контроль к группе наземного эксперимента по моделированию 30-суточного космического полета в макете полетной аппаратуры "БИОС-МЛЖ" (n=8) 0,208±0,022 Группа биологического контроля - наземного эксперимента по моделированию 30-суточного космического полета в макете полетной аппаратуры "БИОС-МЛЖ" (n=8) 0,214±0,017 Группа реадаптации, обследованная спустя 7 суток после наземного моделирования 30-суточного космического полета в макете полетной аппаратуры "БИОС-МЛЖ" (n=8) 0,197±0,023 Виварийный контроль к группе 7-суточной реадаптации после наземного моделирования 30-суточного космического полета в макете полетной аппаратуры "БИОС-МЛЖ" (n=8) 0,212±0,018 Условные обозначения: * - p<0,05 по сравнению с соответствующим виварийным контролем; ** - p<0,05 по сравнению с соответствующим биологическим контролем. Описание: D:\атякшин\2015\ИМБП\Ильин\рисунки в статью\В статью желудок_сведение_стрелки сведене.jpg Рис. 1. Особенности гистоархитектоники и тинкториальных свойств ретикулярных волокон в мышечной оболочке желудка мышей С 57 black. Фиксация: 10% нейтральный формалин. Методика: импрегнация азотнокислым серебром по методу Фута. Увеличение: А, Б, В, Д - об х 60, Г, Е - об х 100. А-Б. Виварийная группа животных. Определяются ретикулярные волокна в мышечной оболочке на продольном (А) и поперечном (Б) срезах пластов гладких миоцитов (обозначены стрелкой). В-Г. Группа космического полета. Выявляется редукция ретикулярных волокон в интерстиции мышечной оболочки, определяются признаки фрагментации и гранулярного распада (обозначено стрелкой). Д-Е. Группа 7-суточной послеполетной реадаптации. Высокое содержание ретикулярных волокон в интерстиции мышечной оболочки (обозначены стрелками). Выводы. Факторы космического полета, прежде всего невесомость, приводили к адаптивному ремоделированию соединительной ткани желудка, которое проявлялось уменьшением численности коллагеновых волокнистых структур в различных оболочках желудка, изменением их гистотопографии и тинкториальных характеристик. Обсуждаются гравитационно-зависимые изменения соединительной ткани желудка в условиях микрогравитации, в том числе, процессы фибриллогенеза, регенерации внеклеточного матрикса и лизиса волокнистых структур соединительной ткани.

About the authors

D A Atiakshin

Voronezh State Medical University

Email: Earth-mars38@yandex.ru

References