AN INFLUENCE ON THE PERIPHERAL M-OPIOID RECEPTORS ALTERS THE ACTIVITY OF THESE RECEPTORS IN RAT BRAIN

Full Text

Актуальность. К настоящему времени известно, что эндогенная опиоидная система мозга является одной из важнейших систем регуляции гомеостаза. Она играет важную роль в механизмах различных физиологических процессах, в том числе таких, как болевая чувствительность, эмоциональный стресс , пищевое поведение, процессы терморегуляции и другие [Gein, 2014; Ide et al., 2010; Morley et al., 1983; Rance et al. 2013;). Эндогенная опиоидная система состоит из центрального и периферического отделов, разделенных гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ). Установлено, что структура опиоидных рецепторов и эндогенных опиоидных пептидов в ЦНС и на периферии одинакова, однако центральные и периферические функции эндогенной опиоидной системы различны, что достигается непроницаемостью ГЭБ для большинства опиоидных пептидов [Egleton et al., 1998]. В связи с этим, центральные и периферические функции эндогенной опиоидной системы исследуются раздельно. В наших недавних экспериментах показано, что центральное и периферическое звенья эндогенной опиоидной системы функционируют как единое целое, взаимодействуя между собой на принципе реципрокности. Это положение базируется на разнонаправленном действии агонистов и антагонистов мю-опиоидных рецепторов, не проникающих через ГЭБ, на болевую чувствительность, пищевое поведение и на центральные механизмы опиатной зависимости [Судаков и др., 2009; Судаков и др., 2010; Chumakova et al, 2011]. Однако, нейрохимические механизмы этих эффектов остаются до сих пор неясными. Целью работы явилось изучение характеристик центральных мю-опиоидных рецепторов при периферическом введении лигандов этих рецепторов, не проникающих через ГЭБ. Материал и методы исследования. Работа была выполнена на 24 крысах самцах линии Вистар с начальной массой 140-180 г. Эксперименты проводились в соответствии с требованиями приказа № 267 МЗ РФ (19.06.2003 г.), а также в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (ФБГНУ НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, протокол №1 от 3.09.2005 г). Животные были разделены на три группы (по 8 животных в каждой группе). Первой группе животных внутрибрюшинно (в/б) вводили лоперамид (Sigma) в дозе 5мг/кг. Второй группе крыс в/б вводили налоксона метиодид (Sigma) в дозе 5мг/кг. Третьей группе животных в/б вводили эквивалентный объём 0,9% раствора хлорида натрия. Через 30 минут после введения вышеперечисленных веществ животных декапитировали, извлекали головной мозг, помещали его дорзальной поверхностью на чашку Петри во льду и проводили выделение структур мозга: среднего мозга и фронтальной коры. С целью проведения радиолигандного анализа мю-рецепторов исследуемую структуру мозга гомогенизировали в 25 мл 50 мМ трис-НСl буфера рН 7,7 (4оC) в гомогенизаторе типа Даунса. Полученную суспензию центрифугировали при 30000g 15 минут при 4оС. Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в первоначальном объеме 50 мМ трис-НСl буфера рН 7,7 при 25оС. Затем суспензию в течение 40 минут инкубировали при 37оС, а затем вновь центрифугировали. Полученный осадок ресуспендировали в 25 мл 50 мМ трис-НСl буфера рН 7,7 при 25оС. В надосадочной жидкости проводили изучение связывающей активности µ-опиоидных рецепторов методом радиорецепторного анализа, используя в качестве лиганда µ-опиоидных рецепторов [3Н]-ДАГО (Amersham, Великобритания). Одновременно в супенантанте производили определение белка по методу Лоури с использованием предварительной обработки суспензии мембран дезоксихолатом натрия. Для определения связывающей активности µ-опиоидных рецепторов была взята реакционная смесь общим объемом 0,5 мл, которая содержала 50 мкл раствора бацитрацина в конечной концентрации 50 мкг/мл; 50 мкл меченого лиганда; 150 мкл мембранной суспензии белка, конечная концентрация которого составляла от 0,6-0,8 мг/мл и 300 мкл 50 мМ трис-HCl буфера рН 7,4. Если реакционная смесь помимо 50 мкл меченного лиганда содержала 50 мкл немеченого лиганда, то объём 50 мМ трис-HCl буфера рН 7,4 составлял 250 мкл. Реакцию связывания проводили в течение 1 часа при 25Со при интенсивном перемешивании. Специфическое взаимодействие меченного тритием ДАГО с μ-опиоидных рецепторов определяли как разницу количества связанной с мембранами радиоактивности при общем связывании (в отсутствии немеченого ДАГО) и при неспецифическом связывании (в присутствии 1000-кратного избытка немеченого ДАГО). Реакцию останавливали быстрой фильтрацией проб через стекловолокнистые фильтры GF/B (Whatman, Великобритания) с использованием аппарата фирмы Millipore (Франция). Фильтры промывали 6 мл трис-HCl буфера рН 7,4, подсушивали на воздухе и помещали во флаконы для сцинтилляционного счета, а затем заливали 7мл стандартного диоксанового сцинтиллятора. Исследуемые показатели подсчитывали на сцинтилляционном спектрометре RackBeta 1219 (LKB, Швеция) с эффективностью счета не ниже 30%. В качестве критериев связывающей способности рецепторов использовали Кd (константу диссоциации) - величину, обратную сродству рецепторов к лиганду, и Вmax, которое отражает число мест связывания лиганда. Математическую обработку результатов радиорецепторного анализа проводили с помощью программы LIGAND. Статистическую обработку результатов проводили с использованием рангового теста Вилкоксона. Полученные результаты и их обсуждение. Полученные данные представлены в таблице 1. В результате исследования установлено, что однократное введение агониста мю-опиоидных рецепторов лоперамида приводило к достоверному снижению числа рецепторов этого подтипа в среднем мозге и фронтальной коре (табл.1). В то же время при однократном введении антагониста этих рецепторов налоксона метиодида число мю-опиоидных рецепторов достоверно увеличивалось во фронтальной коре (табл.1). Следует отметить, что сродство рецепторов к лиганду ни при введении лоперамида, ни при введении налоксона метиодида не изменялось. Таблица. Влияние периферического введения лигандов мю-опиоидных рецепторов на характеристики радиоланднового связывания в среднем мозге и фронтальной коре. Группы исследования Средний мозг Фронтальная кора К d (нмоль) B max фмоль/мг/ белка К d (нмоль) B max фмоль/мг/ белка Контроль (NaCl) 7,2 ± 1,9 162 ± 42 5,0 ± 1,3 272 ± 53 Лоперамид 4,2 ± 0,7 51 ± 18* 3,7 ± 0,4 107 ± 39* Налоксона метиодид 3,9 ± 0,8 180 ± 63 6,1 ± 1,1 421 ± 90* * - р<0,05 по сравнению с крысами контрольной группы. Выводы. Таким образом, полученные данные в очередной раз подтверждают гипотезу реципрокного взаимодействия центрального и периферического звена эндогенной опиоидной системы [Судаков & Тригуб, 2008]. Подавление активности периферического отдела антагонистом этой системы налоксона метиодидом вызывало увеличение плотности мю-опиоидных рецепторов в коре мозга, что по-видимому, и обуславливало наблюдаемый нами ранее анальгетический эффект [Судаков и др., 2009]. Полученные данные позволяют предположить, что активация периферических опиоидных рецепторов лоперамидом приводит к подавлению активности центрального звена, по видимому в основном за счет существенного снижения плотности опиоидных рецепторов в коре мозга. Таким образом, в данном исследовании впервые показано разнонаправленное воздействие периферического введения лоперамида и налоксона метиодид на подсистему мю опиоидных рецепторов коры мозга крыс, проявляющееся в изменении плотности рецепторов Bmax в указанной структуре.

About the authors

S K Sudakov

FSS P.K. Anokhin Research Institute of Normal Physiology

Email: s-sudakov@nphys.ru

T V Proskuryakova

FBGU V.P.Serbsky "Federal Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology " the Ministry of Health

V A Shokhonova

FBGU V.P.Serbsky "Federal Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology " the Ministry of Health

V G Bashkatova

FSS P.K. Anokhin Research Institute of Normal Physiology

References