CELL-FREE DNA IN RAT’S CEREBROSPINAL FLUID UNDER EMOTIONAL STRESS LOAD

Full Text

Актуальность. Многочисленные исследования посвящены изучению свойств и функций внеклеточной ДНК (вкДНК), циркулирующей в крови. Было показано, что вкДНК в крови является регулятором целого ряда физиологических процессов, а также может выступать в качестве маркера различного рода заболеваний [10; 13]. Однако недостаточно литературных данных о вкДНК, присутствующей в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ). В последние годы появляется все больше информации об участии вкДНК в развитии патологических процессов и о связи биологической активности вкДНК с ее молекулярными свойствами и концентрацией [9; 12]. Так, Родес и соавт. было показано, что при наличии опухолей в нервной системе, в ликворе детектируется вкДНК с опухолеспецифичными геномными изменениями, источником которой являются раковые клетки [15]. Также было показано, что в ЦСЖ пациентов с болезнью Паркинсона обнаруживается вкДНК, и ее состав и концентрация существенно отличаются от таковых вкДНК, циркулирующей в крови [1]. Известен также факт обнаружения вкДНК плода в ЦСЖ женщин в предродовой период [7], что свидетельствует о возможности существования механизмов проникновения вкДНК через гистогематические барьеры. Было показано, что при стрессорной нагрузке концентрация вкДНК в крови возрастает [2]. Однако вопрос о том, происходит ли в стрессовых условиях изменение концентрации вкДНК в ЦСЖ, остается по-прежнему актуальным и открытым. Целью данной работы являлось исследование уровня вкДНК в ЦСЖ крыс с различной поведенческой активностью в тесте «открытое поле» в норме и условиях иммобилизационной стрессорной нагрузки. Материал и методы исследования. В работе были использованы 22 самца крыс Вистар массой 200-220 г. Исследования проводили в соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Индивидуальную поведенческую активность крыс определяли в тесте “открытое поле” с использованием компьютерной программы регистрации параметров двигательной активности «Open Field Sequentional Test V.2» и расчетом индекса двигательной активности (ИА) как отношения суммы пересеченных периферических и центральных секторов к сумме латентных периодов первого движения и выхода в центр. Известно, что поведенчески активные животные являются прогностически устойчивыми к стрессорным нагрузкам. Пассивные особи - прогностически предрасположенными к неблагоприятному воздействию стресса [3]. К активным особям были отнесены 9 животных со значением ИА менее 0.8, к пассивным - 10 крыс с ИА более 1.5 [3]. Была также определена группа из 3 амбивалентных крыс со средними значениями коэффициента - от 0.8 до 1.5. Забор ЦСЖ осуществляли под анестезией хлоралгидратом из большой цистерны головного мозга двукратно с интервалом в 10 дней по ранее разработанной методике [4]. При этом вторую пункцию проводили после эмоционального стресса (ЭС), индуцированного иммобилизацией крыс на плоской платформе за четыре конечности в течение 2.5 часов. Полученные образцы ликвора быстро замораживали и хранили при -200С. ЦСЖ доводили физиологическим раствором до объема 400 мкл, а затем проводили выделение вкДНК фенольным методом [1]. Концентрацию вкДНК определяли на флуориметре EnspireTM 2300 (Perkin Elmer) по флуоресценции Picogreen (Invitrogen, США) при длинах волн возбуждения 480 нм и эмиссии 520 нм. Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью программного пакета Statistica 6.0. Для проверки гипотезы о различии независимых выборок использовали U-тест Манна-Уитни. Результаты представляли в виде медианы значений и межквартильного интервала Ме [25%; 75%]. Для исследования связи признаков использовали непараметрический анализ по Спирмену. Полученные результаты и их обсуждение. Медианы концентраций вкДНК в ликворе активных, пассивных и амбивалентных животных в норме составили 27, 68 и 20 нг/мл соответственно (табл. 1). Несмотря на то, что нами не было обнаружено статистически значимых различий между группами, в группе поведенчески активных животных наблюдалась тенденция к большему уровню вкДНК по сравнению с остальными двумя. Объем ликвора, который в норме удавалось отобрать, был примерно одинаков для всех групп животных. Статистический анализ концентраций вкДНК в ликворе по группам после эмоционального стресса не обнаружил различий между группами акивных и пассивных животных. Однако медианы концентраций вкДНК в ликворе пассивных, активных и амбивалентных животных после иммобилизационного стресса составили 32, 46 и 23 нг/мл соответственно. Как следует из оценки соответствующих верхних границ межквартильных интервалов, после ЭС концентрация вкДНК в ЦСЖ поведенчески активных животных демонстрировала тенденцию к снижению, а у предрасположенных - наоборот, к повышению. Таблица 1. Уровень вкДНК и объем ликвора в большой цистерне мозга у крыс с различной эмоциональной резистентностью в норме и ЭС. Показатели Группы животных предрасположенные к стрессу n=10 устойчивые к стрессу n=9 амбивалентные n=3 контроль стресс контроль стресс контроль стресс концентрация вкДНК, нг/мл 27 [23;56] 32 [24;73] 68 [25;80] 46 [28;60] 20 [20;22] 23 [23;26] объем ЦСЖ, мкл 86 [81;90] 86 [81;87] 88 [76;89] 84 [78;139] 93 [93;107] 91 [74;100] общее количество ДНК в пробе, нг 2.1 [2.0;6.3] 2.7 [2.0;6.4] 6.1 [2.2;6.5] 6.2 [2.1;6.8] 2.1 [1.9;2.1] 2.1 [1.9;2.3] После стрессорной нагрузки изменения содержания вкДНК были выявлены у 5 из 9 активных животных. При этом у 4 крыс уменьшение концентрации вкДНК сопровождалось увеличением объема аликвот отбираемого ликвора. У 5-ой активной особи концентрация вкДНК увеличивалась, а объем ЦСЖ снижался. Среди пассивных животных изменения концентрации вкДНК в ЦСЖ после стрессорной нагрузки были выявлены у 6 животных из 10: у четырех из них увеличение концентрации вкДНК сопровождалось снижением объема ликвора, у двух наблюдалось уменьшение концентрации вкДНК, причем в одном случае объем ликвора после стресса возрастал, а в другом - не изменялся. У амбивалентных животных концентрация и объем отбираемого ликвора до и после ЭС оставалась на том же уровне. Как в группе активных, так и в группе пассивных крыс нами была выявлена обратная корреляционная зависимость между изменением объема аликвот ликвора, которые удавалось отобрать до и после ЭС, и изменением концентрации вкДНК в данных аликвотах. Коэффициент корреляции Спирмена (R) составил -0.73 и -0.78 при р<0.05 для пассивных(n=10) и активных (n=9) животных соответственно. Интересно отметить, что все изучаемые животные как в норме, так и после ЭС статистически достоверно (р<0.005, U-тест) разделялись на 2 группы - с повышенным 6.5 [6.2;7] (n=9) и низким 2.1 [2;2.1] (n=13) общим количеством вкДНК (в нг) в пробе (табл. 1). При этом в норме среди активных крыс всего 33% животных имели низкое количество вкДНК в ЦСЖ, в то время как доля таких животных среди пассивных особей составила 70%. Низкое количество вкДНК в ЦСЖ было обнаружено и у всех изучаемых амбивалентных животных. После ЭС эта закономерность сохранялась. В группе активных крыс общее количество вкДНК в пробе оставалось постоянным до и после ЭС у 8-ми из 9 животных. У одной крысы наблюдалось снижение общего количества вкДНК в ЦСЖ после стресса. Среди пассивных животных постоянство общего количества вкДНК было отмечено у 8 из 10 животных, а у двух крыс наблюдали прирост и снижение количества вкДНК, соответственно. В данной работе впервые была проведена оценка концентрации вкДНК в ЦСЖ из большой цистерны головного мозга животных с различной поведенческой активностью в тесте «открытое поле». При стрессорных нагрузках у каждого животного могут проявляться различные реакции со стороны гормональных, биохимических и вегетативных показателей организма [6], тест открытого поля оценивает лишь вероятную резистентность особи к эмоциональным нагрузкам. Поскольку у отдельных животных могут проявляться индивидуальные варианты динамики физиологических показателей, нам представлялось важным помимо анализа животных по группам резистентности к ЭС на основе ИА также проводить оценку индивидуальных изменений исследуемых параметров у каждого животного. Выявленная нами тенденция к большему уровню вкДНК у группы активных животных совпадает с результатами, полученными ранее при исследовании вкДНК в плазме крови крыс с разной индивидуальной эмоциональной устойчивостью [11]. Концентрация вкДНК в плазме крови устойчивых к стрессу животных также превышала таковую у предрасположенных, но в крови это различие было выражено более явно. Поскольку в литературных источниках [11] определение концентрации вкДНК в плазме крови крыс проводилось тем же методом, что и в данном исследовании, интересным представлялось провести сравнительную оценку концентраций вкДНК в крови и ЦСЖ в норме у крыс с различной поведенческой активностью. Значения концентраций вкДНК в плазме крови пассивных и активных животных составили соответственно 60[52;69] (n=17) и 155[134;174] (n=11) нг/мл. Таким образом, очевидно, что концентрация вкДНК в ЦСЖ крыс была ниже, чем в плазме крови в 2.1 и 3.0 раза для пассивных и активных животных соответственно. Рассчитанные соотношения имеют один порядок с ранее полученными результатами на людях - концентрация вкДНК в ЦСЖ пациентов с болезнью Паркинсона оказалась в 3.3 ниже, чем в плазме крови [1]. Считается, что источниками вкДНК, циркулирующей в биологических жидкостях, являются некротические и апоптотические клетки, а также процессы активной секреции из жизнеспособных клеток [16]. Известно, что ЭС индуцирует неспецифический окислительный стресс (ОС) в организме, сопровождающийся массовой гибелью клеток, что в свою очередь приводит к изменению концентрации и свойств вкДНК, циркулирующей в крови [2]. В мозге стрессовые воздействия индуцируют эксайтотоксичность и нейровоспаления, также приводящие к клеточной гибели [17], а, следовательно, к выбросу вкДНК в экстраклеточное пространство. Кроме того, ранее в работе Строуна и Анкера была показана возможность проникновения вкДНК в мозг через гемато-энцефалический барьер [8]. Поэтому в данной работе нам представлялось интересным проверить, происходят ли изменения концентрации вкДНК, циркулирующей в ЦСЖ при ЭС. Нами не была выявлена статистическая достоверность изменений концентрации вкДНК в ЦСЖ после ЭС, индуцированного 2.5ч иммобилизацией за 4 конечности, в группах поведенчески пассивных, активных и амбивалентных животных. Также не удалось установить связь между прогностической резистентностью животных к ЭС и изменением концентрации вкДНК в ЦСЖ после стресса. Возможно, значительное изменение уровня вкДНК в ЦСЖ происходит лишь в случае развития хронических патологий мозга - болезней Паркинсона, Альцгеймера, злокачественных новообразований [1; 14; 15]. Острые расстройства, такие как ЭС, могут не вызывать существенных изменений, поскольку вкДНК, выбрасываемая в экстраклеточное пространство при гибели клеток мозга, может поглощаться соседними клетками и расщепляться внеклеточными эндонуклеазами, не успевая попасть в желудочки. Другими возможными причинами отсутствия достоверных различий могут служить малый объем выборок животных, сравнительно небольшая длительность стрессорного воздействия, а также наложение процессов расщепления, появления свежей вкДНК в ЦСЖ и изменения скорости локального мозгового кровотока после стресса. По общему количеству ДНК в образцах все животные статистически достоверно разделялись на 2 группы - с низким и высоким общим количеством вкДНК в ЦСЖ. Причем, в группе поведенчески активных животных преобладали особи с высоким общим количеством вкДНК в ликворе, а среди пассивных и амбивалентных- наоборот, с низким. Полученный нами результат свидетельствует о том, что вкДНК, циркулирующая в биологических жидкостях, в перспективе может быть использована в качестве уникального показателя предрасположенности животного к стрессорным воздействиям. Выявленная нами обратная корреляционная зависимость между изменениями объема аликвот ликвора и концентрации в них вкДНК при ЭС как у предрасположенных, так и у устойчивых к стрессу животных при сохранении общего количества вкДНК в пробе постоянным может свидетельствовать существовании механизма жесткой регуляции уровня вкДНК в желудочках мозга. Такой механизм может являться одной из форм адаптации организма и, в частности, мозга к стрессовым воздействиям. В настоящее время неясно, несет ли выявленный нами феномен постоянства общего количества вкДНК в аликвотах ликвора какую-либо физиологическую функцию. Для ответа на этот вопрос необходимы дальнейшие исследования. Выводы. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что поведенчески пассивные, активные и амбивалентные в тесте «открытое поле» животные в норме различаются по концентрации и общему количеству вкДНК в ЦСЖ желудочков мозга. Среди активных (прогностически устойчивых к стрессорным нагрузкам) крыс преобладают особи с высоким уровнем вкДНК в ликворе, среди пассивных (прогностически предрасположенных к стрессу) и амбивалентных - с низким. При ЭС у активных и пассивных крыс происходят изменения объема отбираемых аликвот ликвора и уровня вкДНК в них, а также активируются механизмы, препятствующие изменению общего количества ДНК в ликворе. Выявленные нами закономерности могут являться частью механизма адаптации мозга к стрессирующим воздействиям и требуют дальнейшего более тщательного исследования. Данные, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о перспективности исследования вкДНК в ЦСЖ животных с различной эмоциональной резистентностью и позволяют надеяться, что вкДНК, циркулирующая в биологических жидкостях, в перспективе может быть использована в качестве уникального показателя предрасположенности животных к стрессорным воздействиям.

About the authors

O S Grigorchuk

P.K.Anokhin institute of normal physiology

Email: o.grigorchuk@nphys.ru

P E Umriukhin

P.K.Anokhin institute of normal physiology

Email: pavelum@mail.ru

References