STUDYING PHENOLIC COMPOUNDS OF FRUITS OF NORTH AMERICAN SPECIES OF CRATAEGUS

Full Text

Актуальность. Одной из актуальных задач современной фармацевтической науки является поиск отечественных растительных сырьевых источников биологически активных веществ (БАВ) для создания на их основе препаратов сердечно-сосудистого действия. К таким растениям относятся боярышники, содержащие разные группы БАВ. Род боярышник - Crataegus L. семейства Rosaceae Juss. очень полиморфный и насчитывает более 1000 видов, распространенных в умеренных и реже в субтропических областях Северного полушария. Родина боярышника - Северная Америка, в основном ее восточная часть от Ньюфаундленда до гор Северной Мексики. В России растут около 90, в Украине - 23 вида. Официнальными в России являются 14 видов, из которых в Украине растут и культивируются 5 видов [1, 4, 7, 9-14]. Североамериканские виды боярышников, известные в восточноевропейских и западноевропейских странах как садово-парковые культуры, недостаточно изучены в качестве возможных перспективных растений для введения в официальную номенклатуру (БАВ). В работах И.А.Самылиной наряду с прибалтийской и таджикской группами боярышников детально изучались виды североамериканской группы: б. крупноколючковый, б. мягковатый, б. вееровидный, б. Арнольда, б. остро-колючковый, б. овальный, б. зазубренный, б. миссурийский, б. канадский, б. шарлоховидный, б. Дугласа, б. шамплейнский, б. Робсока, б. страшный. Виды исследовались в сравнении с фармакопейными [5, 6]. В результате в ГФ XI издания вместо цветков двух видов и плодов пяти видов, фармакопейными стали 14 видов боярышника - производящие цветки и 11 видов - производящие плоды, но североамериканские виды не вошли в номенклатуру [2]. Целью нашей работы стало фитохимическое исследование плодов североамериканских видов боярышников, наиболее распространенных в культуре в России и в Украине. Материал и методы исследования. Объектами исследования служили плоды боярышника канадского - C. сanadensis Sarg. (ботанический сад университета им. Каразина и окрестности г. Харькова), боярышника мягковатого - С. submollis Sarg., боярышника Арнольда - С. arnoldiana Sarg. и боярышника вееровидного - С. flabellata Koch (окрестности г.Курска), которые были заготовлены в августе и сентябре 2005 г. Для исследования использовали химические и физико-химические методы анализа. Качественные реакции на БАВ проводились по известным методикам. Идентификацию веществ проводили с использованием тонкослойной хроматографии (ТСХ), двумерной бумажной хроматографии (БХ) и препаративной ТСХ. Для тонкослойной хроматографии использовали пластинки “Sorbfil”, системы растворителей: этилацетат-этанол (95:5) и хлороформ - уксусная кислота (3:1), насыщенная водой. Для БХ использовалась бумага “Filtrak” №12, системы: I направление - этилацетат - муравьиная кислота - вода (10:2:3) и II направление - 2% уксусная кислота. Хромогенными проявителями служили фильтрованный УФ-свет (354 нм), пары аммиака, 1% раствор AICI3 в этаноле, 1% спиртовый раствор ванилина и концентрированная серная кислота, диазотированная сульфаниловая кислота и 5% раствор натрия гидроксида, свежеприготовленный 0,2% раствор нингидрина в ацетоне. Количественное определение суммы флавоноидов проводили с помощью методов хроматоспектрофотометрии и дифференциальной спектрофотометрии. Метрологические характеристики количественного определения суммы флавоноидов осуществлялась с помощью статистических методов программного обеспечения Microsoft Office для персонального компьютера. Полученные результаты и их обсуждение. Химическимическими реакциями и хроматографическими методами анализа были обнаружены гидроксикоричные кислоты, гидроксикумарины, флавоноиды, дубильные вещества, тритерпеновые сапонины, аминокислоты. Фенольные вещества определяли по флуоресценции в УФ-свете до и после обработки парами аммиака, а также по сопоставлению Rf и Rs с достоверными образцами веществ. В плодах исследуемых видов в сравнении с достоверными образцами идентифицированы хлорогеновая (Rf·100=85 - I; 70 и 55 - II системы), неохлорогеновая (Rf·100=75 - I; 75 и 65 - II системы) и кофейная (Rf·100=95 - I; 50 и 34 - II системы) кислоты, которые в системе 2% уксусной кислоты разделялись на цис- и транс-изомеры. На хроматограмме эти соединения дают положительную реакцию с бромтимоловым синим, хлоридом оксида железа, диазотированной сульфаниловой кислотой. Из объектов эти вещества были выделены препаративной хроматографией. Результаты УФ-спектрального анализа их спиртовых растворов с ионизирующими добавками позволили установить, что исследуемые вещества относятся к монокофеилхинным (хлорогеновая и неохлорогеновая) и кофейной кислотам. Флавоноидные соединения выявляли в УФ-свете по флуоресценции и ее изменениям при обработке хромогенными реактивами. Хроматографически в сравнении с достоверными образцами идентифицированы флавоноиды: гиперозид (Rf·100=68 - I и 28 - II системы); биокверцетин (Rf·100=52 - I и 28 - 36 системы) и витексин (Rf·100=65 - I и 28 - II системы). Данные УФ-спектров элюатов веществ с ионизирующими и комплексообразующими добавками из хроматограм подтвердили наличие этих флавоноидов, обнаружены максимумы поглощения для гиперозида (λ max - 360, 267 пл., 268), биокверцетина - 360, 265 пл., 255 и витексина - 335, 268 [7, 8]. Фенольные соединения, выявленные в исследуемых видах, представлены на схемах двумерных хроматограмм (рис.1, 2, 3, 4). Описание: 92_7 Рис.1. Хроматограмма экстракта плодов боярышника мягковатого В плодах боярышника канадского обнаружены свыше 22 соединений фенольной природы, из которых 5 были отнесены к флавоноидам. Описание: 92_8 Рис.2. Хроматограмма экстракта плодов боярышника канадского В плодах боярышника Арнольда обнаружены свыше 23 соединений фенольной природы, из которых 4 были отнесены к флавоноидам. Описание: 92_9 Рис.3. Хроматограмма экстракта плодов боярышника Арнольда В плодах боярышника вееровидного обнаружено около 28 соединений фенольной природы, из них 4 относятся к флавоноидами. Описание: 92_10 Рис.4. Хроматограмма экстракта плодов боярышника вееровидного Европейская фармакопея (Ph Eur) предлагает определять в плодах боярышника процианидины в пересчете на цианидина хлорид, а в листьях и цветках - сумму флавоноидов в пересчете на гиперозид [10]. Однако основной вклад в биологическое действие препаратов боярышника принадлежит гиперозиду, по которому и проводится стандартизация препаратов [5, 6, 9]. ГФ XI регламентирует содержание флавоноидов не менее 0,06% в перерасчете на гиперозид, но предлагаемая методика довольно трудновоспроизводима [2, 5]. УФ-спектры спиртовых извлечений (70% спирт) из плодов боярышников представлены (сухой остаток 18%) на рис.5. Рис.5. УФ-спектры экстрактов плодов боярышников в 96% спирте. Как видно на рисунке, УФ-спектры очищенных от липофильных веществ спиртовых вытяжек из плодов боярышников не имеют типичных для флавонолов выраженных максимумов поглощения І полосы, поэтому, целесообразно было изучить дифференциальные спектры. Нами было определено содержание суммы флавоноидов в перерасчете на гиперозид двумя вариантами, основанными на методах хроматоспектрофотометрии и дифференциальной спектрофотометрии. По первому - из полученных двумерных хроматограм (БХ) пятна флавоноидов вырезали, элюировали, доводили в мерной колбе до метки и определяли оптическую плотность при длине волны 360 нм в перерасчете на гиперозид, используя его удельное поглощение E1%1см при этой длине волны. По второму - определение оптической плотности спиртовых экстрактов проводили после образования комплексов флавоноидов с AlCl3 при длине волны 410 нм и определяли содержание флавоноидов в пересчете на гиперозид, используя для сравнения интенсивность поглощения комплекса стандартного образца гиперозида с AlCl3 при той же длине волны [3]. Были получены сопоставимые результаты. Метрологические характеристики количественного определения суммы флавоноидов по второму варианту приведены в таблице. Таблица. Метрологические характеристики количественного определения суммы флавоноидов, m=5, P=0,95 Xi Хср S2 Scp t(P, n) Доверительный интервал e, % С. submollis Sarg. 0,1086 0,1105 0,1431.10-4 0,1692.10-2 2,78 0,1105 ± 0,47.10-2 4,2560 0,1102 0,1155 0,1124 0,1055 C. canadensis Sarg. 0,1986 0,1952 0,1084.10-4 0,1473.10-2 2,78 0,1952 ± 0,41.10-2 2,0977 0,1902 0,1975 0,1940 0,1955 С. arnoldiana Sarg. 0,1379 0,1372 0,0935.10-4 0,1368.10-2 2,78 0,1372 ± 0,38.10-2 2,7756 0,1402 0,1324 0,1356 0,1388 С. flabellata Koch 0,1286 0,1251 0,1233.10-4 0,1570.10-2 2,78 0,1251 ± 0,44.10-2 3,4897 0,1256 0,1242 0,1196 0,1275 Полученные результаты являются предпосылкой для дальнейшего исследования боярышников североамериканской группы как возможных источников БАВ и введения их в номенклатуру официнальных растений. Выводы. 1. В плодах североамериканских видов боярышников - б. мягковатого, б. канадского, б. Арнольда и б. вееровидного обнаружены гидроксикоричные кислоты, гидроксикумарины, флавоноиды, дубильные вещества, тритерпеновые сапонины и аминокислоты. 2. Идентифицированы хлорогеновая, неохлорогеновая и кофейная кислоты, а также гиперозид, биокверцетин и витексин. 3. Установлено количественное содержание флавоноидов в плодах исследуемых боярышников, которое составляет (в %) для б. мягковатого - 0,1105±0,47.10-2, для б. канадского - 0,1952±0,41.10-2, для б. Арнольда - 0,1372±0,38.10-2 и для б. вееровидного - 0,1251±0,44.10-2.

About the authors

N F Sidora

N V Kovalyova

A M Komissarenko

A N Goncharov

References