Study of dynamics of plasma HIF-1α and HIF-2α levels in patients with COVID-19 pneumonia

Full Text

Актуальность. Коронавирус тяжёлого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), поражая альвеолярные клетки, вызывает повреждение лёгких и системную гипоксию [1]. Гипоксия усиливает воспаление в лёгких, создавая порочный круг усугубления гипоксии. Это приводит к полиорганной недостаточности, окислительному стрессу, эндотелиальной дисфункции с микрососудистыми повреждениями, патологическому ангиогенезу, повышенному тромбообразованию [1, 2].

Изменения, происходящие в организме, зависят от выраженности, длительности и скорости развития гипоксии [3]. Выделяют острую (от 2 до 24 часов) и хроническую (более 24 часов) гипоксию [4]. Чередование циклов гипоксии и нормоксии (интермиттирующая гипоксия) [5] представляет наибольшую опасность, так как вызывает усиление оксидативного стресса, клеточные повреждения, повышение тромбообразования, системное воспаление [6].

Известно, что ключевым регулятором клеточного ответа на гипоксию является гетеродимерный, транскрипционный фактор, индуцированный гипоксией (HIF) [7]. Он состоит из кислород-зависимой α-субъединицы и конститутивно экспрессируемой β-субъединицы [4]. Активация HIF-α запускает транскрипцию генов, обеспечивающих адаптацию к гипоксии [7].

На сегодняшний день известно 3 изоформы HIF-α: HIF-1α, наиболее активна при острой гипоксии [4]; HIF-2α экспрессируется при хронической гипоксии [4]; HIF-3α предположительно регулирует HIF-1α и HIF-2α [8]. Изоформы HIF-1α и HIF-2α имеют схожую стабильность, однако при длительном воздействии гипоксии из-за перераспределения кислорода и реактивации пролилгидроксилазы происходит выход HIF-1α из клеток. Данный процесс обуславливает механизм переключения сигналов с HIF-1 на HIF-2 для активации адаптации к условиям гипоксии [9].

В недавнем исследовании было установлено, что при интермиттирующей гипоксии уровень HIF-1α выше, чем при хронической, в то время как HIF-2α не изменяется [5].

Обладая общими механизмами регуляции, HIF-1α и HIF-2α в разной степени участвуют в запуске каскадов транскрипционного ответа на гипоксию [10]. HIF-1α в основном отвечает за переход от окислительного фосфорилирования к анаэробному гликолизу, стимуляцию эритропоэза, продукцию провоспалительных цитокинов (фактора некроза опухоли-α, интерлейкин-6) [10]. Экспрессируясь, преимущественно в М1 макрофагах, HIF-1α регулирует активность индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS), что может способствовать прогрессированию воспаления [11]. В тоже время iNOS в условиях гипоксии индуцирует выработку оксида азота (NO), играющего важную роль в регуляции тонуса сосудов и обеспечении тканевой перфузии [12]. HIF-1α и HIF-2α в условиях недостаточного поступления кислорода к тканям регулируют процессы ангиогенеза, прежде всего, за счёт активации фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-A) [13]. Помимо прочего, повышенная экспрессия HIF-2α стимулирует гены, участвующие в метаболизме железа [10], а также способствует формированию противовоспалительного фенотипа М2-макрофагов [14].

Активность HIF-1α и HIF-2α традиционно оценивают иммуногистохимически, однако в последние годы активно изучают их уровни в плазме крови. В зарубежной литературе определение уровня HIF-1α в сыворотке крови показало клиническое значение в оценки состояния пациентов при внутричерепных кровоизлияниях и тяжёлом течении реперфузионных аритмий [15, 16]. По данным отечественных источников уровень HIF-1α в крови ассоциирован с исходом острой декомпенсации хронической сердечной недостаточности [17].

Данные нашего исследования показали, что низкий уровень HIF-1α при госпитализации у пациентов с крайне тяжёлым COVID-19 связан с нарушением гипоксической адаптации на фоне воспаления [18, 30].

Кроме того, нами был разработан способ прогнозирования исходов тяжёлого течения острой COVID-19 пневмонии. В разработанной модели оценивались уровни HIF-1α в плазме крови, уровень креатинина в сыворотке крови, степень поражения лёгких по данным компьютерной томографии и частота сердечных сокращений [19].

Изучение гипоксии у пациентов, находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) особенно актуально, учитывая высокий риск сепсиса, полиорганной недостаточности и других жизнеугрожающих осложнений.

Понимание механизмов адаптации и повреждения, вызванных гипоксией, а также разработка эффективных стратегий мониторинга и коррекции кислородного баланса, могут существенно улучшить результаты лечения пациентов в ОРИТ и снизить показатели летальности.

Поэтому целью нашей работы было изучить возможность использования уровня HIF-1α и HIF-2α в плазме крови для мониторинга гипоксии у пациентов с тяжёлым течением коронавирусной (COVID-19) пневмонии.

Материал и методы исследования. Исследование одобрено на заседании ЛЭК РязГМУ (протокол № 2 от 16.09.2022). В исследование было включено 112 участников, проходивших лечение с 14.01.2021 по 22.07.2021 ГБУ РО «ГКБСМП» (г. Рязань) и разделённых на 3 группы: 1) 90 пациентов с COVID-19 пневмонией (47 женщин, 43 мужчины); 2) 10 пациентов с острой респираторной вирусной инфекцией (ОРВИ) (4 женщины, 6 мужчин); 3) 12 здоровых добровольцев (7 женщин, 5 мужчин) (контрольная группа). Критерии включения в исследования для всех групп: возраст от 30 до 90 лет, информированное согласие. Критерии включения для 1-й группы: подтвержденный COVID-19 (полимеразная цепная реакция (ПЦР) +); для 2-й и 3-й групп отрицательный ПЦР-тест на SARS-CoV2. Критерии исключения для всех групп: беременность, онкологические заболевания, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), синдром приобретённого иммунного дефицита (СПИД); для группы здоровых добровольцев – отсутствие бронхолёгочных заболеваний в анамнезе, перенесённых ОРВИ в течении 1 месяца. Пациенты 1-й и получали стандартную терапию (глюкокортикостероиды, антикоагулянты, противовирусные) согласно тяжести COVID-19 пневмонии и актуальным клиническим рекомендациям (Временные методические рекомендации: Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19), версия 10 от 08.02.2021.). Пациенты 2-й группы получали противовирусную терапию, а также терапию сопутствующих хронических заболеваний в соответствии с актуальными клиническими рекомендациями (Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) у взрослых 2021 год).

Информация о пациентах, такая как демографические характеристики, сведения о респираторной поддержке, а также результаты лабораторных и инструментальных исследований, была получена путем тщательного анализа медицинской документации.

Для учёта влияния сопутствующих хронических заболеваний использовали индекс коморбидности Чарлсона [20]. Оценка эффективности респираторной терапии и показаний к искусственной вентиляции лёгких (ИВЛ) проводилась по индексу частоты дыхания – оксигенации (ROX) (отношение сатурации (SpO₂) к фракции кислорода во вдыхаемом воздухе (FiO₂) к частоте дыхательных движений) [21]. Использованы индекс отношения тромбоцитов к лимфоцитам (PLR) и индекс отношения нейтрофилов к лимфоцитам (NLR) как маркеры воспаления [22].

Забор крови проводили на 1-е и 7-е сутки. Использовали пробирки BD Vacutainer Plus с гепарином натрия (17 МЕ/мл).

Уровни HIF-1α, HIF-2α, iNOS и VEGF-A определяли методом конкурентного иммуноферментного анализа (ELISA) (Cloud-Clone Corp., Китай). Концентрации рассчитывали по калибровочной кривой (выражение в нг/мл и пг/мл). Метаболиты NO определяли по методу Метельской [23].

Статистический анализ проводили в Jamovi 2.3. Нормальность распределения оценивали с помощью теста Шапиро-Уилка. В связи с отклонением от нормальности использовали непараметрические методы: для сравнения нескольких групп – тест Краскела-Уоллиса с пост-хок анализом (критерий Двасса-Стила-Кричлоу-Флигнера); для зависимых выборок – U-критерий Манна-Уитни; для парных сравнений – критерий Уилкоксона. Анализ корреляционных взаимосвязей осуществлялся с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Полученные результаты и их обсуждение. В результате проведённого исследования было установлено, что различий по возрасту (критерий Краскела-Уоллиса равен 4,74; p=0,093) и индексу массы тела (критерий Краскела-Уоллиса равен 1,19; p=0,551) нет. Индекс коморбидности Чарлсона был выше у пациентов с COVID-19 пневмонией по сравнению с группой здоровых добровольцев (4 [3;6] и 2 [2;3]; p=0,002), при этом различий с пациентами с ОРВИ выявлено не было (4 [3;6] и 4 [2;6]; p=0,855).

У пациентов с COVID-19 пневмонией наблюдался более низкий уровень SpO2 без кислородной терапии (90 [86;92] %) в сравнении с больными с ОРВИ (96 [93;97]%) и с группой контроля (99 [95;99]%) (критерий Краскела-Уоллиса равен 41,69; p<0,001).

В контрольной группе уровень HIF-1α был значимо ниже, чем в группах пациентов с COVID-19 пневмонией и ОРВИ. Концентрации iNOS и NO у больных с COVID-19 были выше, чем в группе контроля, но при этом не имели различий с группой с ОРВИ. Выявленные различия в уровнях HIF-1α, iNOS и NO в плазме крови между пациентами с COVID-19 пневмонией и здоровыми добровольцами позволяют выдвинуть гипотезу о развитии адаптационных механизмов к гипоксии. Уровень VEGF-A в исследуемых группах значимо не отличался (Таблица 1).

Таблица 1 – Сравнение исследуемых биохимических показателей (Me [Q₁; Q₃])

Показатель	COVID-19 пневмония, n=90 (1)	ОРВИ, n=10 (2)	Здоровые добровольцы, n = 12 (3)	P1-2
HIF-1α, нг/мл	1,82 [1, 6;2, 25]	1,81 [1, 64;2, 11]	0,565 [0, 56;0, 582]	p1-2=0,977 p2-3=0,009 p1-3<0,001
iNOS, нг/мл	2,61 [2, 52;3, 02]	2,38 [2, 19;2, 58]	2,44 [2, 34;2, 56]	p1-2=0,034 p2-3=0,787 p1-3=0,002
NO, мкмоль/мл	66,5 [54, 4;78, 6]	74,4 [49, 5;82]	42,5 [37, 2;43, 9]	p1-2=0,819 p2-3=0,006 p1-3<0,001
VEGF-α, пг/мл	668 [655;688]	659 [651;669]	687 [663;737]	p1-2=0,528 p2-3=0,147 p1-3=0,212

 

HIF-1α-опосредованный ответ на гипоксию зависит от клинического статуса пациента и применяемых методов респираторной поддержки. Ввиду этого группа пациентов с COVID-19 пневмонией была разделена на две подгруппы: 1) 35 больных, находившихся под наблюдением в ОРИТ; 2) 55 человек, получавших лечение в профильном отделении.

При поступлении у пациентов первой группы была большая степень поражения лёгких по данным компьютерной томографии (КТ) (50 [30;60]% против 35 [25;40]%; p=0,002) и ниже SpO2 на фоне начатой респираторной терапии по сравнению со второй группой больных (93 [89;95]% против 95 [94;97]%; p<0,001). У больных ОРИТ, показатели индекса ROX, были ниже, чем в группе сравнения (8,85 [6, 49;11, 8] против 12 [10, 2;13, 5]; p<0,001), несмотря на значимо большую степень респираторной терапии (FiO2 – (48 [40;60]% против 40 [40;40]%; p=0,003 и скорость потока кислорода (O2) – (7 [5;12] л/мин против 5 [5;6] л/мин; p=0,004)).

На 7-е сутки лечения у больных ОРИТ значимых изменений в уровне SpO2 (93 [89;95]% и 91 [88;94]%; p=0,922) и объёме поражения лёгких (50 [30;60]% и 45 [35;60]%; p=0,363) не было несмотря на увеличение скорости потока O2 (7 [5;12] л/мин и 20 [9;20] л/мин; p<0,001) и уровня FiO2 (48 [40;60]% и 65 [51;80]%; p <0,001). Индекс ROX снизился на 28,59% (8,85 [6, 49;11, 8] и 6,32 [5, 63;9, 03]; p=0,006) относительно дня госпитализации.

У пациентов профильного отделения на 7-й день лечения увеличился уровень SpO2 (95 [94;97]% и 97 [95;98]%; p=0,045), уменьшился процент поражения лёгочной ткани (35 [25;40]% и 25 [10;35]%; p=0,001), снизился объём кислородной поддержки (уровень FiO2 – (40 [40;40]% и 28 [21;40]%; p<0,001; скорость потока O2 – (5 [5;6] л/мин и 0 [0;5] л/мин; p<0,001)), наблюдался прирост индекса ROX на 62,5% (12 [10, 2;13, 5] и 19,5 [11, 9;25, 1]; p <0,001).

Уровень HIF-1α в плазме крови в первой группе при поступлении был ниже, чем у пациентов из профильного отделения, а уровень HIF-2α в плазме крови был сопоставим (Таблица 2). Сниженный уровень HIF-1α в плазме крови в совокупности с высокой степенью поражения лёгких, сниженными показателями SpO2 и индекса ROX на фоне высокой респираторной поддержки даёт основание предполагать о преимущественном воздействии хронической гипоксии у пациентов ОРИТ на момент поступления. У пациентов профильного отделения высокий уровень HIF-1α предположительно указывает на адаптацию к острой гипоксии. Динамика активности HIF-1α в плазме крови под влиянием различных видах гипоксии соотносятся с продемонстрированными ранее изменениями, происходящими на уровне клеток [4].

Уровень гемоглобина (HHb), NLR и PLR при поступлении не различались между группами. У пациентов ОРИТ выявлено значительное повышение С-реактивного белка (СРБ) и ферритина по сравнению с пациентами из профильного отделения, что свидетельствуют о выраженном воспалительном процессе (Таблица 2) [24, 25].

Таблица 2 – Динамика лабораторных показателей у больных с COVID-19 (Me [Q₁; Q₃])

Показатель	1 группа, (n=35)	2 группа, (n=55)	P1-2
При поступлении в стационар
HIF-1α, нг/мл	1,71 [1, 5;1, 82]	2,08 [1, 72;2, 5]	0,005
HIF-2α, нг/мл	1,65 [1, 61;1, 69]	1,65 [1, 62;1, 71]	0,751
iNOS, нг/мл	2,65 [2, 5;2, 9]	2,61 [2, 52;3, 04]	0,734
VEGF-A, пг/мл	686 [666;700]	662 [648;676]	0,012
NO, мкмоль/мл	66,7 [51, 6;82, 6]	66,3 [56, 6;76, 3]	0,622
СРБ, мг/л	90 [55, 8;136]	52,8 [23, 9;98, 1]	0,009
Сыв. ферритин, мкг/л	295 [221;523]	236[199;296]	0,014
HHb, г/л	133 [120;143]	132 [119;142]	0,562
PLR	272 [167;334]	301 [184;415]	0,291
NLR	8,47 [5, 21;12, 8]	7,4 [5, 05;12, 3]	0,584
Через 7 дней
HIF-1α, нг/мл	2,24 [1, 94;2, 55]	1,99 [1, 67;2, 57]	0,458
HIF-2α, нг/мл	1,58 [1, 56;1, 6]	1,75 [1, 66;1, 8]	0,006
iNOS, нг/мл	2,92 [2, 52;3, 36]	2,7 [2, 58;2, 98]	0,932
VEGF-A, пг/мл	668 [667;671]	676 [658;694]	0,6
NO, мкмоль/мл	74,3 [72, 6;78, 8]	63,9 [49, 2;74, 9]	0,044
СРБ, мг/л	59 [10, 7;88, 9]	4 [0, 5;10, 1]	<0,001
Сыв. ферритин, мкг/л	324 [258;550]	154 [136;204]	<0,001
HHb, г/л	135 [120;144]	128 [118;142]	0,473
PLR	427 [272;597]	264 [181;358]	0,002
NLR	19,8 [10, 5;55, 4]	7,76 [5, 34;10, 3]	<0,001

 

В группе ОРИТ наблюдался повышенный уровень VEGF-A в плазме крови, по сравнению со второй группой, что можно охарактеризовать, как проявление адаптации к гипоксии. Статистически значимых различий в показателях iNOS и NO не было установлено (Таблица 2).

На 7-й день лечения уровень HIF-2α в первой группе пациентов был ниже, а концентрация NO, СРБ и ферритина выше, чем у второй группы. Повышение концентрации NO, может быть обусловлено накоплением токсичных пероксинитритов (ONOO⁻) и прогрессированием оксидативного стресса, усугубляющих микроциркуляторные нарушения и коагулопатию при тяжёлом течении COVID-19 пневмонии [26].  Индексы PLR и NLR также были значимо больше у пациентов ОРИТ, что свидетельствует о прогрессировании системного воспаления [19].

К 7-му дню лечения в первой группе наблюдался прирост уровня HIF-1α (в 1,31 раз (p=0,031), также наблюдалась тенденция к снижению уровня HIF-2α в 1,04 раза (p=0,768). У второй группы пациентов была выявлена обратная картина: HIF-2α значимо увеличился в 1,06 раз (p=0,016), а в показателях HIF-1α имелась тенденция к снижению в 1,05 раз (p=0,855).

Увеличение HIF-1α в плазме крови у пациентов ОРИТ на 7-е сутки лечения на фоне повышения респираторной поддержки сходно с изменениями уровня HIF-α в клетках, продемонстрированными в недавнем исследовании [5] и может быть обусловлено не только феноменом перехода HIF, но и развитием интермиттирующей гипоксии. Выявление закономерностей в ответах организма на гипоксию может служить для врача дополнительным ориентиром при принятии решения об изменении или усилении методов респираторной поддержки.

В группе больных ОРИТ на фоне высокой активности HIF-1α сохранялся системный воспалительный ответ, что подтверждается увеличением СРБ (p=0,035), NLR (p <0,001) и PLR (p=0,022) к седьмому дню. Наблюдалось значимое увеличение уровня HHb (p=0,037), что предположительно согласуется с представлениями о механизмах индуцированного гипоксией эритропоэза, приводящего к снижению количества здоровых эритроцитов и функционального HHb [27-29].

Отсутствие изменений в показателях NLR (p=0,765) и PLR (p=0,174) у пациентов профильного отделения, а также снижение СРБ (p <0,001) и сывороточного ферритина (p=0,034) предположительно указывает на противовоспалительную активность HIF-2α.

Разнонаправленные изменения изоформ HIF-α в плазме крови, продемонстрированные в нашем исследовании, соотносятся с динамикой HIF-α в клетках по данным зарубежной литературы [9] и указывают на активацию механизмов адаптации в зависимости от вида гипоксии: HIF-1α отвечает за быструю адаптацию, обусловленную острой и интермиттирующей гипоксией, а HIF-2α отражает переход к долговременной адаптации и противовоспалительной регуляции, что согласуется со снижением маркеров воспаления (СРБ, ферритин).

Корреляционный анализ при поступлении выявил положительную зависимость уровня HIF-1α в плазме крови от индексом ROX (R=0,545; p<0,001), уровня SpO2 (R=0,406; p<0,01) и iNOS (R=0,375; p<0,05), а также отрицательную связь с длительностью нахождения больных в ОРИТ (R=-0,451; p<0,01) и степенью поражения лёгких (R=-0,425; p<0,01). Уровень HIF-2α в плазме крови отрицательно коррелировал с уровнем HHb (R=-0,432; p<0,01). Полученные данные указывают на возможность практического использования HIF-1α при выборе метода респираторной терапии, в том числе при раннем переводе пациента на ИВЛ.

К 7-м суткам лечения наблюдалась более прочная положительная связь между уровнем HIF-1α и iNOS, чем в день поступления (R=0,481; p<0,05). На 7-е сутки HIF-2α положительно коррелировал с индексом ROX (R=0,461; p<0,05) и отрицательно с СРБ (R=-0,529; p<0,05), сывороточным ферритином (R=-0,754; p<0,05), HHb (R=-0,533; p<0,05), PLR (R=-0,411; p<0,05) и NLR (R=-0,393; p<0,05), а также с длительностью пребывания больных в стационаре (R=-0,619; p<0,01) и в ОРИТ (R=-0,686; p<0,01), что может нести важную значимость в прогнозировании исхода COVID-19 пневмонии.

Выявленные корреляционные взаимосвязи уровня HIF-1α в плазме крови с клиническими проявлениями и данными инструментальной и лабораторной диагностики позволили разработать модель прогнозирования исходов заболевания у пациентов с тяжёлым течением COVID-19 пневмонии. В разработанную модель были включены показатели уровня HIF-1α в плазме крови, частота сердечных сокращений, степень поражения лёгких по данным КТ органов грудной клетки и уровень креатинина в сыворотке крови [19].

Выводы. Таким образом, уровни HIF-1α, iNOS и NO в плазме крови могут служить маркерами адаптации к гипоксии у пациентов с COVID-19. Кроме того, повышение HIF-1α в плазме крови на фоне усиления респираторной поддержки у пациентов в ОРИТ может указывать на развитие интермиттирующей гипоксии. Взаимосвязь уровней HIF-2α в плазме крови с маркерами острого воспаления (СРБ, сывороточный ферритин, PLR и NLR) в процессе лечения предположительно указывает на активность адаптационных механизмов при гипоксии.

Установленные взаимосвязи уровней изоформ HIF в плазме крови с индексом ROX потенциально могут быть рекомендованы к использованию в клинической практике при выборе метода респираторной терапии (HIF-1α – при поступлении больных в стационар; HIF-2α – в динамике лечения), а также в прогнозировании исхода заболевания.

About the authors

Sergei Nikolaevich Raytsev

Ryazan State Medical University named after Academician I.P. Pavlov of the Russian Ministry of Health

Author for correspondence.
Email: raitsevsergei@yandex.ru

Postgraduate student of the Department of Biological Chemistry

Russian Federation, 390026, Russia, Ryazan, Vysokovoltnaya Street, 9

Valentina Zvyagina

Ryazan State Medical University named after Academician I.P. Pavlov of the Russian Ministry of Health

Email: vizvyagina@yandex.ru

Doctor of Medical Sciences, Associate Professor, Professor of the Department of Biological Chemistry

Russian Federation, 390026, Russia, Ryazan, Vysokovoltnaya Street, 9

Roman Kalinin

Ryazan State Medical University named after Academician I.P. Pavlov of the Russian Ministry of Health

Email: kalinin-re@yandex.ru

MD, Professor, Head of the Department of Cardiovascular, X-ray Endovascular Surgery, and Radiation Diagnostics

Russian Federation, 390026, Russia, Ryazan, Vysokovoltnaya Street, 9

Edward Belsky

Ryazan State Medical University named after Academician I.P. Pavlov of the Russian Ministry of Health

Email: ed.bels@yandex.ru

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor at the Department of Faculty Therapy named after Professor V.Ya. Garmash

Russian Federation, 390026, Russia, Ryazan, Vysokovoltnaya Street, 9

Oksana Albertovna Tsareva

Ryazan State Medical University named after Academician I.P. Pavlov of the Russian Ministry of Health

Email: tsareva.oksana1966@yandex.ru

Candidate of Sciences. Biol. sciences, Associate Professor of the Department of Biology

Russian Federation, 390026, Russia, Ryazan, Vysokovoltnaya Street, 9

Olga Raitseva

Ryazan State Medical University named after Academician I.P. Pavlov of the Russian Ministry of Health

Email: olgaananyina@icloud.com

student

Russian Federation, 390026, Russia, Ryazan, Vysokovoltnaya Street, 9

References