The effect of peroxynitrite on tgf- β1 -induced endothelial-mesenchymal 
transition in primary endothelial cell cultures in vitro

Nina Jansugovna Mzhavanadze; Мжаванадзе Нина Джансуговна; Ekaterina Andreyevna Strelnikova; Стрельникова Екатерина Андреевна; Roman Kalinin; Калинин Роман Евгеньевич; Igor Aleksandrovich Suchkov; Сучков Игорь Александрович; Julia Vladimirovna Abalenikhina; Абаленихина Юлия Владимировна; Natalya Vasilevna Korotkova; Короткова Наталья Васильевна

doi:10.18499/2070-9277-2026-29-1-114-123

The effect of peroxynitrite on tgf- β1 -induced endothelial-mesenchymal transition in primary endothelial cell cultures in vitro

Authors: Mzhavanadze N.J.¹, Strelnikova E.A.¹, Kalinin R.¹, Suchkov I.A.¹, Abalenikhina J.V.¹, Korotkova N.V.¹
Affiliations:
1. Ryazan State Medical University named after Academician I.P. Pavlov of the Russian Ministry of Health
Issue: Vol 29, No 1 (2026): Опубликован 27.03.2026
Pages: 109-118
Section: Биохимия
URL: https://new.vestnik-surgery.com/index.php/2070-9277/article/view/11574
DOI: https://doi.org/10.18499/2070-9277-2026-29-1-114-123

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Statistics

Abstract

The aim of the study was to assess the effect of peroxynitrite (ONOO−), as a mediator of nitrosative stress (NS), on key indicators of TGF-β-induced endothelial-mesenchymal transition (EndMT) in primary cultures of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) in vitro.

Material and methods. Primary HUVEC cultures at passage 3 were grown in ECGM culture medium for 3 days until a monolayer was formed. EndMT was then induced using recombinant TGF-β1 (10 ng/ml) at 37°C for 72 hours, after which ischemia-reperfusion was modeled by adding various concentrations of ONOO−. The effectiveness of ischemia-reperfusion was confirmed by determining the level of nitric oxide II (NO) using the fluorescent probe DAF FM. At the end of TGF-β1 and ONOO− treatment, cell lysates were prepared from the primary HUVEC cultures. In the cell lysates, the expression (relative amount) of proteins characterizing EndMT was determined by Western Blot: endothelial markers - cluster of differentiation 31 (CD31) and von Willebrand factor (vWF), as well as mesenchymal markers - fibronectin (FN) and vimentin (VIM).

Results. The effectiveness of modeling NS using various concentrations of ONOO− was confirmed: exposure to peroxynitrite led to an increase in the level of NO fluorescence labeled with DAF-FM. The NO level in the experimental groups at 1, 10, 50, 100, 250, and 500 μM was higher by 28, 63, 71, 87, 122, and 156%, respectively, compared to the control.

The combined effect of TGF-β1 and peroxynitrite, compared to the isolated effect of TGF-β1, was characterized by a statistically significant increase in CD31 expression at concentrations of 1, 10, 50, 100, 250, 500 µM by 168.6%, 169.4%, 154.3%, 142.6%, 65.6%, and 57.9%, respectively, and a statistically significant increase in vWF expression at concentrations of 1, 10, 50, and 100 µM by 23.1%, 31.3%, 24.4%, 29.4%, and 31.9%, with no change at 500 µM.

The effect of TGF-β1 and peroxynitrite, compared to the isolated effect of TGF-β1, was characterized by a statistically significant decrease in FN expression at concentrations of 1, 10, 50, and 500 µM by 36%, 25%, 20%, respectively, and a reduction in VIM expression at concentrations of 1, 10, 50, 250, and 500 µM by 94.1%, 89.6%, 85.3%, 66.2%, and 78.7%, respectively.

Conclusion. The effect of the nitrosative stress mediator peroxynitrite (ONOO−) in a TGF-β-induced EndMT model is associated with increased expression of endothelial markers CD31 and vWF and decreased expression of mesenchymal markers FN and VIM, indicating an inhibitory effect of peroxynitrite on endothelial-mesenchymal transition in vitro.

Keywords

endothelial-mesenchymal transition (EndMT), transforming factor beta 1 (TGF-β1), nitrosative stress, peroxynitrite (ONOO−), von Willebrand factor (vWF), cluster of differentiation 31 (CD31), fibronectin (FN), vimentin (VIM), HUVEC culture.

Full Text

Актуальность. Эндотелиально-мезенхимальный переход (endothelial-mesenchymal transition, EndMT) вызывает высокий интерес у исследователей и рассматривается как патофизиологическая основа множества заболеваний, сопровождающихся хроническим воспалением. EndMT является потенциальным звеном патогенеза сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний, формирования микроокружения и метастазирования опухолей, а также фиброза [1]. Эндотелиально-мезенхимальный переход — это процесс, при котором эндотелиоциты теряют экспрессию специфических маркерных белков и клеточных функций и приобретают мезенхимальные свойства, такие как экспрессия мезенхимальных маркеров, сократительная способность и производство компонентов ВКМ (внутриклеточного матрикса). При EndMT эндотелиоциты теряют межклеточные контакты, базальную мембрану, клеточную полярность и обретают способность к миграции, инвазии, высокой пролиферации и снижению барьерной функции. Вместе с изменением морфологии клеток меняются и продуцируемые ими белки. Происходит полная или частичная потеря эндотелиальных маркеров, например, кластер дифференцировки 31 (cluster of differentiation 31, CD31), фактор фон Виллебранда (von Willebrand factor, VWF), рецептора к фактору роста эндотелия сосудов-2 (vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2), кадгерина сосудистого эндотелия (vascular endothelial cadherin; VE-cadherin), и приобретение мезенхимальных маркеров, таких как фибронектин (fibronectin), виментин (vimentin), α-гладкомышечный актин (alpha smooth muscle actin, αSMA), гладкомышечный протеин 22α (Smooth Muscle Protein 22-alpha, SM22α), фибробласт-специфичный белок 1 (fibroblast specific protein 1, FSP1), кальпонин и коллагены [2, 3]. Таким образом, EndMT отвечает за повышенную фибропролиферативную васкулопатию и фиброз в ряде заболеваний, а также считается новым механизмом генерации активированных миофибробластов [4]. Современное понимание EndMT подчеркивает его сложную роль в развитии заболеваний. Каноническим индуктором EndMT является трансформирующий фактор роста бета (transforming growth factor beta, TGF-β), а также пути Wnt/Notch, высокий уровень глюкозы, гипоксия, воспаление и воздействие цитокинов, например, фактора некроза опухоли-α и интерлейкина-1β.

Оксид азота (II) (NO) выступает ключевой сигнальной молекулой в регуляции сосудистого гомеостаза. NO в организме животных и человека синтезируется из L-аргинина с помощью NО-синтаз. По характеру индукции и действию существует 3 изоформы NО-синтазы: Са₂⁺-независимая (индуцибельная, iNOS) (2 тип) и конститутивные Са₂⁺-зависимые и кальмодулинзависимые NО-синтазы – нейрональная (1 тип, nNOS) и эндотелиальная (3 тип, eNOS) [5, 6]. Если nNOS и eNOS регулируют нормальные физиологические процессы, то iNOS в норме отсутствует и является участником развития патологии [7]. В сердечно-сосудистой системе экспрессия iNOS связана с развитием заболеваний, таких как атеросклероз. Повышенная регуляция и активация iNOS способствуют выработке пероксинитрита (ONOO−) и могут способствовать эндотелиальной дисфункции [8]. Повышение уровня NO может служить источником активных форм азота (АФА) и приводить к сосудистой дисфункции, опосредованной окислительным стрессом.

Продукция АФА вызывает повреждение клеточных мембран, белковых молекул, митохондрий, эндоплазматической сети, нуклеиновых кислот и ферментов, что приводит к нарушению функции и гибели клеток [9]. Дисбаланс АФА и антиоксидантных систем приводит к нарушению равновесия в окислительно-восстановительной системе клеток – нитрозативному стрессу (НС). Накапливающиеся данные говорят о том, что нитрозативный стресс играет важную роль в патогенезе множества заболеваний, однако механизмы повреждающего воздействия остаются не до конца изученными [10].

Нитрозативный стресс (НС), как важное нарушение равновесия окислительно-восстановительной системы клеток, тесно связан с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Отмечается существенный вклад НС в развитие ишемии и реперфузионного повреждения миокарда, аневризмы аорты, сердечной недостаточности, гипертонии и атеросклероза. Химическая природа НС заключается в реакции оксида азота (NO) с супероксидом (O₂⁻) в результате которой образуется анион пероксинитрита. Пероксинитрит нитрозилирует клеточные мембраны, белковые молекулы, митохондрии, эндоплазматическую сеть, нуклеиновые кислоты и ферменты, что приводит к нарушению функции или гибели клеток [11, 12]. На данный момент остается не до конца изученным вклад НС в развитие EndMT.

Целью нашего исследования стала оценка влияния пероксинитрита на ключевые показатели TGF-β – индуцированного эндотелиально-мезенхимального перехода в эндотелиальных клетках вены пуповины человека HUVEC in vitro.

Материал и методы исследования. Объект исследования. В качестве объекта исследования были выбраны эндотелиальные клетки вены пуповины человека (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC). Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России (протокол №2, от 16.09.2022). Первичные клеточные культуры HUVEC были получены из биологического материала в лаборатории клеточных технологий РязГМУ по методике Crampton (2007) [13].

Протокол выделения первичных культур HUVEC. Биоматериал получали от здоровых женщин-доноров, подписавших добровольное информированное согласие. Участки пуповин доставляли в лабораторию, обрабатывали 70% спиртом. Вену пуповины промывали физиологическим раствором, просвет сосуда катетеризировали и наполняли раствором 0,1% коллагеназы (кат. № GC305013-1g, «Servicebio», Китай), концы пуповины лигировали и инкубировали при температуре 37 градусов в течение 15 минут. После окончания инкубации с ферментом вену пуповины промывали теплым фосфатно-солевым буферным раствором DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline, кат. № Р061Е, «ПанЭко», Россия) над пробиркой, центрифугировали, клеточный осадок высаживали на предварительно желатинизированный культуральный пластик (кат. № 70025', «SPL Lifesciences», Китай) [14]. В экспериментах использовалось 3 клеточные линии от разных доноров.

Синтез пероксинитрита. В основе метода лежит реакция взаимодействия нитрита натрия с пероксидом водорода. Для получения пероксинитрита изначально создавали кислую среду. Для этого на льду к смеси 0,25 М пероксида водорода и концентрированной серной кислоты добавляли 0,28 М нитрита натрия, затем сразу же изменяли рН на щелочную среду мгновенным добавлением 0,85 М гидроксида натрия, для стабилизации пероксинитритного аниона. Удаление избытка перекиси производили добавлением диоксида марганца, который выдерживали до затихания реакции (прекращения выделения пузырьков), осадок отфильтровывали. В полученном растворе определяли конечную концентрацию пероксинитрита спектрофотометрическим методом на спектрофотометре «СФ-2000» («Спектр», Россия) по оптической плотности раствора при 302 нм (Ɛ302=1670 М-1×cм-1) [15].

Моделирование EndMT. Первичные культуры HUVEC засеивали в 6-луночные планшеты (кат. № 30006', «SPL Lifesciences», Китай) в количестве 3х105 клеток на лунку и культивировали в течение 3 суток до образования монослоя в питательной среде для эндотелиоцитов ECGM (Endothelial Cell Growth Medium, кат. № 211-500, «Cell Applications», США). Далее проводили преинкубацию клеточных культур в течение 3 часов путем смены среды ECGM на бессывороточную среду Игла (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) and F-12 Nutrient Mixture, DMEM F-12). Затем клеточную культуру инкубировали с рекомбинантным человеческим трансформирующим фактором роста бета-1 (recombinant transforming growth factor-beta1, TGF-β1) (кат. № CYT-716, «ProsPec», Израиль) в концентрации 10 нг/мл в течение 3 суток для моделирования TGF-β – индуцированного EndMT, результаты которого опубликованы авторами ранее и подтверждают эффективность методики [16].

Моделирование НС. После индукции TGF-β-индуцированного EndMT в первичных культурах HUVEC моделировали нитрозативный стресс. Для этого питательную среду с TGF-β1 удаляли и заменяли новой с добавлением пероксинитрита в конечных концентрациях 1;10;50;100;250 и 500 мкМ, временем экспозиции 2 часа.

Определение уровня NO. Методика основана на детекции флуоресцентного индикатора – DAF FM (4-амино-5-метиламино-2',7'-дифторфлуоресцеин диацетат) (кат. № D23841 Invitrоgen, США) [17]. Зонд DAF-FM проникает через мембрану, деацетилируется внутриклеточными эстеразами и превращается в непроникающий сквозь мембраны флуоресцирующий бензотриазол (DAF Т). Интенсивность флуоресцентного свечения позволяет выполнить количественную оценку внутриклеточного уровня NO. Продукцию оксида азота в клетках анализировали на спектрофлуориметре (RF 6000 Shimadzu, Япония) по интенсивности флуоресценции λext=495 нм, λem=515 нм. Полученные значения пересчитывали на количество клеток, и выражали в ед.фл./10^*6 клеток.

Блоттинг. После моделирования EndMT и НС, клетки снимали с лунок раствором трипсин (0,25% трипсина с солями Хенкса, «ПанЭко», Россия) и промывали фосфатно-солевым раствором DPBS из расчета 1 × 106. Затем готовили клеточные лизаты в буфере RIPA (кат. № G2002-30ML, «Servicebio», Китай) для определения относительного количества маркеров EndMT методом Вестерн блот. Концентрацию белка в лизате клеток оценивали методом Бредфорда [18]. 20 мкг белков клеточного лизата смешивали с буфером Laemli (BioRad, США), содержащим 2-меркаптоэтанол, в соотношении 1:2, далее фракционировали с помощью 10% полиакриламидных гелей SDS и переносили на нитроцеллюлозную мембрану, проводили блокировку (Servicebio, Китай). После инкубации с первичными антителами при 4 ° C в течение ночи мембраны затем инкубировали со вторичными антителами в течение 60 мин. Блоты визуализировали и анализировали с использованием системы ChemiDocXRS+ («Bio-Rad», США) и нормализовали по GAPDH.

Далее в лизатах клеток определяли относительное количество белков, характеризующих EndMT: эндотелиальных маркеров EndMT c использованием первичных кроличьих моноклональных антител CD31 (кат. № AF6191, «Affinity Biosciences», Китай) и von Willebrand factor, vWF (кат. № AF3000, «Affinity Biosciences», Китай); мезенхимальных маркеров - c использованием первичных кроличьих моноклональных антител Fibronectin (кат. № AF5335, «Affinity Biosciences», Китай) и Vimentin (кат. № AF0292, «Affinity Biosciences», Китай), GAPDH (кат. № AF5161, «Affinity Biosciences», Китай). Количество исследуемых маркеров оценивали относительно содержания белка домашнего хозяйства GAPDH.

Статистическая обработка. Полученные результаты анализировали с помощью пакета статистических программ, оценивали с использованием теста ANOVA. Для оценки статистической значимости различий по сравнению с контролем применяли тест Даннета. Статистически значимыми считали различия при p<0,05. Описанные выше эксперименты повторяли трижды.

Полученные результаты и их обсуждение. При определении оксида азота флуоресцентным зондом DAF-FM было установлено увеличение внутриклеточного количества NO по сравнению с контролем (рис.1). При моделировании нитрозативного стресса влияние пероксинитрита в течение 2 ч приводило к повышению уровня флуоресценции дозозависимым образом, за счет взаимодействия DAF-FM с NO. Уровень NO в опытных группах 1, 10, 50, 100, 250 и 500 мкМ был выше на 28; 63; 71; 87; 122 и 156 % соответственно, по сравнению с контролем. Полученные результаты подтверждают эффективность моделирования НС при помощи различных концентраций пероксинитрита.

Рис. 1. Измерение уровня NO флуоресцентным зондом DAF-FM при моделировании НС различными концентрациями пероксинитрита в первичных культурах HUVEC.

контроль (К) – первичные культуры HUVEC без воздействия пероксинитрита

опытные группы – первичные культуры HUVEC при воздействии различных концентраций пероксинитрита. Значения р – *р<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ****p<0,0001

Определение эндотелиальных маркеров EndMT (CD31 и vWF). Результаты определения эндотелиальных маркеров (CD31 и vWF) после инкубации клеточных культур HUVEC с TGF-β1 (10 нг/мл) и моделирования НС показали статистически значимые изменения уровня данных маркеров. На рис.2 представлены результаты вестерн-блот анализа количества эндотелиальных маркеров EndMT в лизатах первичных культур HUVEC.

При воздействии TGF-β1 было отмечено снижение уровня CD31 на 45,8 % и vWF на 24,3 % по сравнению с группой без воздействия TGF-β1 или пероксинитрита (К-). Сочетанное воздействие TGF-β1 и пероксинитрита вызвало повышение CD31 относительно (К-) при концентрациях 1, 10, 50, 100,250,500 мкМ на 122,8%; 123,6%; 108,5%; 96,7%; 19,8%; 12,1% соответственно. Сочетанное воздействие TGF-β1 и пероксинитрита вызвало повышение CD31 относительно (К+) при концентрациях 1, 10, 50, 100,250,500 мкМ на 168,6%; 169,4%; 154,3%; 142,6%; 65,6%; 57,9% соответственно.

При воздействии TGF-β1 и пероксинитрита в конечных концентрациях 1 – 250 мкМ уровень vWF статистически значимо не изменялся, а при 500 мкМ снижался на 34,8 % по сравнению с группой без воздействия TGF-β1 или пероксинитрита (К-). Сочетанное воздействие TGF-β1 и пероксинитрита вызвало повышение vWF относительно (К+): при концентрациях 1, 10, 50, 100 мкМ отмечали возрастание на 23,1%, 31,3%, 24,4%, 29,4% и 31,9% и не изменялось при 500 мкМ.

Рис. 2. Относительное количество кластера дифференцировки 31 (CD31, слева) и фактора фон Виллебранда (vWF, справа) в лизатах клеток при индукции EndMT и воздействии различных концентраций пероксинитрита

Примечания: отрицательный контроль (К-) – первичные культуры HUVEC без воздействия TGF-β1 или пероксинитрита; положительный контроль (К+) – первичные культуры HUVEC после воздействия TGF-β1 (индукция EndMT); опытные группы – первичные культуры HUVEC после воздействия TGF-β1 и различных концентраций пероксинитрита;
Значения р – *р<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ****p<0,0001

Определение мезенхимальных маркеров EndMT (FN и VIM). Результаты определения мезенхимальных маркеров (FN и VIM) после инкубации клеточных культур HUVEC с TGF-β1 (10 нг/мл) и моделирования НС показали статистически значимые изменения уровня данных маркеров. На рис.3 представлены результаты вестерн-блот анализа количества мезенхимальных маркеров EndMT в лизатах первичных культур HUVEC. На рис.3 представлено изменение относительного количества мезенхимальных маркеров EndMT в лизатах первичных культур HUVEC.

При воздействии TGF-β1 было отмечено повышение уровня FN на 38,8% и VIM на 39,8% по сравнению с группой без воздействия TGF-β1 или пероксинитрита (К-). Сочетанное воздействие TGF-β1 и пероксинитрита в конечных концентрациях вызвало повышение FN относительно (К-): при концентрациях 1, 10, 50 и 500 мкМ уровень FN статистически значимо не изменялся, а при концентрациях 100 и 250 мкМ отмечали возрастание на 42,9% и 20,6% соответственно. Сочетанное воздействие TGF-β1 и пероксинитрита вызвало понижение FN относительно (К+) при концентрациях 1, 10, 50 и 500 мкМ на 36%, 25,%, 20% соответственно.

Сочетанное воздействие TGF-β1 и пероксинитрита в конечных концентрациях вызвало снижение VIM относительно (К-): при концентрациях 1, 10, 50, 250, и 500 мкМ на 54,3%, 49,8%, 45,5%, 26,4%, 38,8% соответственно. При концентрации 100 мкМ наблюдалось повышение VIM на 27,9%. Сочетанное воздействие TGF-β1 и пероксинитрита вызвало понижение VIM относительно (К+) при концентрациях 1, 10, 50, 250, и 500 мкМ на 94,1%, 89,6%, 85,3%, 66,2%, 78,7% соответственно. При концентрации 100 мкМ наблюдалось повышение VIM на 11,8%.

Рис. 3 – относительное количество фибронектина (FN, слева) и виментина (VIM, справа) в лизатах клеток при воздействии различных концентраций пероксинитрита

Примечание: отрицательный контроль (К-) – первичные культуры HUVEC без воздействия TGF-β1 или пероксинитрита; положительный контроль (К+) – первичные культуры HUVEC после воздействия TGF-β1 (индукция EndMT); опытные группы – первичные культуры HUVEC после воздействия TGF-β1 и различных концентраций пероксинитрита.
Значения р – *р<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ****p<0,0001

Воздействие человеческого рекомбинантного TGF-β1 (10 нг/мл) на первичную культуру HUVEC в течение 3 суток позволяет достоверно индуцировать EndMT in vitro, что подтверждается статистически значимым снижением относительного количества эндотелиальных маркеров EndMT – CD31 и vWF и повышением относительного количества мезенхимальных маркеров Fibronectin и Vimentin в клеточных лизатах.

Окислительный и нитрозативный стресс взаимодействуют с основными провоспалительными, метаболическими путями и механизмами клеточной гибели, играют важную роль в развитии сложных биохимических и структурных изменений, связанных с метаболическими и сердечно-сосудистыми и фиброзными заболеваниями [19]. Однако, молекулярные механизмы, запускающие и поддерживающие патологические процессы, до конца не ясны.

Нитрозативный стресс сопутствует множеству фундаментальных процессов, таких как апоптоз клеток, воспалительные реакции, а также является участником патогенеза различных заболеваний, поэтому существует необходимость поиска и доработки существующих методик моделирования НС. Немногочисленные данные литературы говорят об использовании пероксинитрита и его предшественников для моделирования НС [20].

В данном исследовании мы успешно использовали моделирование нитрозативного стресса с использованием пероксинитрита. В работе было оценено влияние пероксинитрита на ключевые маркеры TGF-β-индуцированного EndMT в первичных культурах эндотелиальных клеток HUVEC для оценки воздействия нитрозативного стресса на изучаемый процесс.

Воздействие пероксинитрита, медиатора нитрозативного стресса, в различных концентрациях на первичные культуры эндотелиальных клеток в состоянии EndMT привело к статистически значимому повышению эндотелиальных маркеров и снижению мезенхимальных маркеров, что может свидетельствовать о том, что пероксинитрит можно рассматривать в качестве нового потенциального ингибитора эндотелиально-мезенхимального перехода.

Выводы. Воздействие медиатора нитрозативного стресса пероксинитрита (ONOO−) в модели TGF-β-индуцированного EndMT ассоциируется с повышением относительного количества эндотелиальных маркеров CD31 и vWF и снижением относительного количества мезенхимальных маркеров FN и VIM, что свидетельствует об ингибирующем влиянии пероксинитрита на эндотелиально-мезенхимальный переход in vitro.