EVALUATION OF THE ANTIOXIDANT PROPERTIES OF 3-ALKOXYCARBONYL-4-ARYL-1,2,3,4-TETRAHYDROBENZO[4,5]IMIDAZO[1,2-a]PYRIMIDINE-2(1H)-ONES

Full Text

Актуальность. Живые клетки организма надежно защищены системой антиоксидантной защиты, которая противостоит повышению выработки активных форм кислорода (АФК). В результате снижения естественной антиоксидантной защиты под воздействием различных факторов, например, радиация, стресс, возрастные изменения, некачественное питание происходит накопление АФК, приводящее к возникновению окислительного стресса, который является причиной и важной составляющей серьезных заболеваний, например, сердечно-сосудистых, бронхолегочных, нейродегенеративных [1]. В медицинской практике в комплексной фармакотерапии подобных патологических состояний используют лекарственные средства с антиоксидантной активностью [2].

Принимая во внимание практическую значимость данного класса лекарственных средств, поиск новых соединений с антиоксидантным действием является важной задачей фармацевтической  и медицинской науки.

В результате фармакологических исследований выявлены перспективные вещества с антиоксидантной активностью, структурной основой которых являются пиримидиновый [3] и бензимидазольный [4] циклы.

В продолжение исследований по поиску новых соединений с антиоксидантной активностью нами проведена оценка антиоксидантного действия 3-алкоксикарбонил-4-арил-1,2,3,4-тетрагидробензо[4, 5]имидазо[1, 2-a]пиримидин-2(1H)-онов, наличие в их структуре легкоподвижного атома водорода сопряженной π-системы дает возможность предположить у них антиоксидантные свойства [5].

Метод использования культуры клеток, как субстрата для проведения реакции, наиболее приближен к условиям in vivo, E.coli является компонентом нормофлоры человека и с успехом используется для создания модели оценки антиоксидантных свойств, как экстрактов растений, так и химических соединений [6].

Материал и методы исследования. Объектами исследования явились 16 соединений – 3-алкоксикарбонил-4-арил-1,2,3,4-тетрагидробензо[4, 5]имидазо[1, 2-a]пиримидин-2(1H)-оны.

Ресинтез объектов исследования I-XVI осуществлен взаимодействием диметилмалоната (диэтилматоната), ароматических альдегидов и 1Н-бензо[d]имидазол-2-амина при кипячении в метаноле (этаноле) в течение 2 часов в присутствии пиперидина [7, 8] по схеме, представленной на рисунке 1.

Ar = 4-BrC6H4 (I, IX), 4-ClC6H4 (II, X), 4-(CH3)2NC6H4 (III, XI), 4-CH3OC6H4 (IV, XII), 4-НОC6H4 (V, XIII), 2,4-(CH3O)2C6H3 (VI, XIV), 4-(C2H5)2NC6H4 (VII, XV), 3-NO2C6H4 (VIII, XVI); R = Me (I-VIII), Et (IX-XVI)

Рис. 1 Схема синтеза

Синтезированные соединения представляют собой бесцветные кристаллические вещества, растворимые в ДМФА, уксусной кислоте, при нагревании в этаноле, практически нерастворимые в воде.

Строение полученных соединений установлено методами ЯМР 1Н- и 13С-спектроскопии. Химические сдвиги протонов в спектрах ЯМР 1Н, а также ядер атомов углеродов в спектрах ЯМР 13С аналогичны, описанным ранее [7, 8]. Согласно полученным спектрам чистота соединений составила 99%.

Для скрининга антиоксидантной активности была выбрана in vitro модель с использованием в качестве субстрата культуры клеток E. coli, способных к биолюминесценции, штамм «Эколюм». Окислительный стресс индуцировали путем добавления 3% раствора пероксида водорода. Измерение флуоресценции проводили с применением микропланшетного ридера Synergy H1 (Biotek, США). В лунку 96-луночного планшета помещались 100 мкл питательной среды Бульон LB по Lennox (ООО «ДИА-М», г. Краснодар), 50 мкл культуры клеток биосенсора E. coli штамм «Эколюм», 25 мкл раствора исследуемого вещества (1*10-3 мМ соединений, растворенных в 1 мл ДМСО), либо ДМСО (контрольный раствор), а также 25 мкл 3% раствора пероксида водорода. Флуоресценцию определяли после экспозиции в течение 40 минут при температуре 37 ºС при длине волны возбуждения 490 нм и длине волны флуоресценции 585 нм. Значение флуоресценции демонстрирует состояние клеток E. coli. При окислительном стрессе под действием сублетальной концентрации раствора пероксида водорода уменьшается интенсивность свечения клеток с целью адаптации. Следовательно, низкое значение флуоресценции по сравнению с контрольной пробой, говорит о повреждении клеток. Более высокое значение по сравнению с контролем, наоборот, свидетельствует о высоком уровне выживаемости клеток, выраженной протекции под действием исследуемого вещества. Для количественного анализа антиоксидантной активности рассчитывалось ингибирование флуоресцентной активности (ИФА) по следующей формуле:

ИФА= (X1-X2) / X1 * 100%,

где Х1 – флуоресценция лунки контрольного раствора, содержащего ДМСО, Х2 – флуоресценция лунки с исследуемым соединением.

Чем меньше значение ИФА, тем меньше влияние повреждающего фактора (пероксида водорода) на клетки. Данная модель позволяет оценить влияние исследуемых веществ на совокупность антиоксидантных ферментов (глутатионпероксидаза, каталаза, супероксиддисмутаза).

В качестве эталона сравнения использовался тролокс – водорастворимая форма витамина Е, который, в настоящее время принят как стандарт для оценки антиоксидантной активности веществ [9].

Результаты статистически обработаны с вычислением критерия Фишера - Стьюдента. Различия считали достоверными при р <0,05.

Структуры всех лигандов были построены и оптимизированы полуэмпирическим методом РМ3 (программа Gaussian 03), и затем были конвертированы в 3D–формат (.pdb) с помощью программы ChemBio3D Ultra 12.0. Моделирование лиганд – рецепторных взаимодействий осуществляли программой AutoDock 4.0 в составе программного комплекса MGL Tools 1.5.6, с помощью Ламарковского генетического алгоритма. При проведении молекулярного докинга мы использовали трёхмерную модель молекулы супероксиддисмутазы (СОД), информация о которой получена из базы данных RCSB Protein Data Bank: PDB ID code: 1ESO [10]. Изначально, все молекулы воды были удалены из структуры белка. Файлы рецептора и лигандов были конвертированы в формат PDBQT–файла, с добавлением недостающих атомов водорода и частичных атомных зарядов по методу Гастейгера.

В процедуре докинга по СОД, при построении Grid–карт за центр были взяты координаты лиганда: x= 11,90, y= 0,55, z= 14,29, с координатами точек (60 × 60 × 60) вокруг каждого моделируемого участка. В результате получено 16 Grid–карт по параметрам для исследуемых соединений.

Полученные результаты и их обсуждение. Результаты исследования антиоксидантной активности 3-алкоксикарбонил-4-арил-1,2,3,4-тетрагидробензо[4, 5]имидазо[1, 2-a]пиримидин-2(1H)-онов представлены в таблице 1.

В результате эксперимента выявлено 4 соединения (VII, IX, XI, XIII) с антиоксидантным действием, превышающем эффект препарата сравнения. Прооксидантное действие проявили все остальные соединения.

Используемая модель позволяет оценить влияние исследуемых веществ на активность совокупности ферментов антиоксидантной защиты (СОД, каталазы, глутатионпероксидазы). Согласно полученным результатам в программе PASS online, соединения III – VIII, XI – XVI (на основе сравнения значений показателя pa – вероятность наличия активности и pi – вероятность отсутствия активности, pa˃pi) являются потенциальными ингибиторами супероксиддисмутазы (СОД). СОД является ключевым эндогенным  антиоксидантным ферментом, который участвует в процессе дисмутации супероксид-аниона в кислород и пероксид водорода, таким образом защищая практически все клетки организма человека от повреждения АФК.

Таблица 1 - Антиоксидантная активность соединений I-XVI на модели окислительного стресса

Соединение	R	Ar	Ингибирование флуоресцентной активности, ИФА, %
I	Me	4-BrC6H4	16,62±2,82*
II	Me	4-ClC6H4	6,09±2,02*
III	Me	4-(CH3)2NC6H4	1,21±1,82
IV	Me	4-CH3OC6H4	4,38±0,88*
V	Me	4-НОC6H4	9,07±1,61*
VI	Me	2,4-(CH3O)2C6H3	1,76±1,07
VII	Me	4-(C2H5)2NC6H4	-5,16±1,90*
VIII	Me	3-NO2C6H4	3,77±1,31*
IX	Et	4-BrC6H4	-0,41±1,48
X	Et	4-ClC6H4	11,95±3,74*
XI	Et	4-(CH3)2NC6H4	-3,31±1,52*
XII	Et	4-CH3OC6H4	1,14±1,74
XIII	Et	4-НОC6H4	-2,65±2,90
XIV	Et	2,4-(CH3O)2C6H3	1,98±2,51
XV	Et	4-(C2H5)2NC6H4	2,75±2,56
XVI	Et	3-NO2C6H4	12,68±2,10*
Тролокс	-	-	-0,04±0,02

* – Результат, имеющий статистически достоверное отличие в сравнении с тролоксом. Результаты приведены в виде средней и ее статистической ошибки (М±m).

 

В эксперименте, при обработке клеток E. coli пероксидом водорода наблюдается индукция активных форм кислорода (АФК), которые оказывают повреждающее действие, интенсивность флуоресценции клеток при этом снижается. СОД способна уменьшить образование АФК (супероксид-анионов), ингибиторы СОД уменьшают защитное действие фермента, усиливают повреждение клеток; потенциальные ингибиторы СОД, обладающие цитостатическими, прооксидантными свойствами могут найти место в лечении раковых заболеваний и латерального амиотрофического склероза [11].  

Для понимания наблюдаемой ингибирующей активности синтезированных соединений в отношении Cu, Zn - СОД из E.coli, были проведены расчеты молекулярного докинга в изучении взаимодействия целевого фермента и синтезированных производных в полученной конформации, с максимальной энергией связывания. Выбор Cu, Zn - СОД для докинга соединений с антиоксидантной активностью связан с тем, что этот фермент играет важную роль в антиоксидантной защите организма, удаляет наиболее активную форму кислорода, осуществляя дисмутацию супероксид-радикалов в пероксид водорода и молекулярный кислород.

По результатам молекулярного докинга синтезированных соединений, были определены максимальная энергия связывания (Be max), аминокислотные остатки с межмолекулярной водородной связью (Н-связь) и гидрофобным взаимодействием (ближайшие остатки аминокислот), окружающие сайт связывания фермента СОД (табл. 2).

Таблица 2 - Участок взаимодействия исследуемых соединений ряда 3-алкоксикарбонил-4-арил-1,2,3,4-тетрагидробензо[4, 5]имидазо
[1,2-a]пиримидин-2(1H)-онов (I - XVI) с активным центром СОД

Соединение	Энергия связывания максимальная (Be max), ккал/моль	Н – связь (остатки аминокислот)	Гидрофобное взаимодействие (ближайшие остатки аминокислот)
I	-7,07	ASP54B, SER54F	LEU135, ARG141
II	-6,38	–	ALA54G, LEU135
III	-6,06	SER54F	LEU135, ARG141
IV	-5,87	ARG141	LEU135
V	-6,49	ALA54G, SER54F	–
VI	-6,35	–	LEU135
VII	-5,74	ASP54B, SER54F	LEU135, ARG141
VIII	-6,08	SER54F	LEU135
IX	-6,05	SER54F, GLU56	LEU135
X	-6,59	ASP54B, SER54F	ALA54G, LEU135, ARG141
XI	-5,95	GLY139, ARG141	ALA54G, LEU135
XII	-6,25	ARG141	–
XIII	-6,26	ALA54G, SER54F	–
XIV	-5,78	SER54F, GLU56	LEU135
XV	-5,38	ARG141	ALA54G, LEU135
XVI	-7,07	ASP54B, GLY139, ARG141	ALA54G, ALA55, LEU135
Тролокс	-4,62	GLY139, ARG141	LEU135

 

Все синтезированные производные (I - XVI) образовали комплекс с целевым ферментом - СОД. Сайт связывания СОД исследуемых соединений содержит остатки аминокислот: аспарагиновая кислота 54В (ASP54B), серин 54F (SER54F), аланин 54G (ALA54G), аланин 55 (ALA55), глутаминовая кислота 56 (GLU56), лейцин 135 (LEU135), глицин 139 (GLY139), аргинин 141 (ARG141). Из таблицы 2 можно предположить, что максимальная ингибирующая активность соединений I, X и XVI с энергией связывания: -7,07; -6,59 и -7,07 ккал/моль, соответственно, обусловлена энергией связи и стабильностью комплекса лиганд-СОД. Минимальные значения Bemax равные -5,38 и -5,74 ккал/моль по результатам молекулярного докинга с СОД, показали соединения XV и VII, соответственно, с прооксидантной (2,75 %) и антиоксидантной (-5,16 %) активностью. Выполнена оценка образованного комплекса с помощью рассчитанного коэффициента корреляции (R) максимальных значений энергии связывания с СОД и экспериментальных значений антиоксидантной активности, с R равным 0,758, полученный результат показывает высокую связь Be max с антиоксидантной активностью.

Переход направления действия анализируемых соединений от прооксидантного к антиоксидантному, связан с уменьшением энергии связывания с СОД. При уменьшении ингибирования целевого фермента, развивается антиоксидантная активность, связанная с СОД: дисмутация супероксид-аниона в кислород и пероксид водорода и защита организма от АФК.

Таким образом, энергия связи соединений I, X и XVI с СОД, с прооксидантной активностью: 16,62, 11,95 и 12,68% оказалась максимальной, среди энергий связывания анализируемых производных (табл. 2).

Выводы. Проведенные исследования молекулярного докинга показали, что образование межмолекулярных водородных связей с аминокислотными остатками: ASP54B, SER54F, ALA54G, GLU56, GLY139 и ARG141, и гидрофобное взаимодействие с остатками аминокислот: ALA55, LEU135, ARG141, играет важную роль в образовании комплекса лиганд - СОД. Это исследование обеспечит новое структурное понимание для поиска ингибиторов СОД – прооксидантов.

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований в ряду 3-алкоксикарбонил-4-арил-1,2,3,4-тетрагидробензо[4, 5] имидазо[1, 2-a]пиримидин-2(1H)-онов в поиске соединений как с антиоксидантным действием, так и прооксидантными свойствами, которые свидетельствуют не только о стимуляции окислительного стресса, но и возможном прямом цитостатическом действии. Непосредственное влияние данного класса веществ на отдельные звенья антиоксидантной системы защиты, а именно фермент СОД будет исследовано
в дальнейшем.

About the authors

Karina Vladimirovna Podchezertseva

Perm State Pharmaceutical Academy of the Russian Ministry of Health

Author for correspondence.
Email: karina.podchezertseva.99@mail.ru

Postgraduate student of the Department of Pharmaceutical Chemistry

Russian Federation, 614990, Russia, Perm, Ekaterininskaya Street, 10.

Nadejda Albertovna Buzmakova

Perm State Pharmaceutical Academy of the Russian Ministry of Health

Email: buzmakova_pfa@mail.ru

PhD, Associate Professor of the Department of Pharmacology

Russian Federation, 614990, Russia, Perm, Ekaterininskaya Street, 10.

Tatyana Mikhailovna Zamaraeva

Perm State Pharmaceutical Academy of the Russian Ministry of Health

Email: tanyapgfa@yandex.ru

Doctor of Chemistry, Associate Professor, Head of the Department of Pharmaceutical Chemistry

Russian Federation, 614990, Russia, Perm, Ekaterininskaya Street, 10

Konstantin Vyacheslavovich Andreukov

Perm State Pharmaceutical Academy of the Russian Ministry of Health

Email: k_andrukov@mail.ru

Dr. of Pharmacy, Professor, Department of Pharmaceutical Chemistry

Russian Federation, 614990, Russia, Perm, Ekaterininskaya Street, 10.

References