Study of the mechanism of interaction of glucoamylase with collagen by ir spectroscopy

Full Text

Актуальность. Использование биополимеров, например, коллагена, для иммобилизации ферментов представляет перспективное направление для изучения в биохимии, биотехнологии, медицине и фармакологии. Закрепление ферментов на носителях расширяет возможности многократного применения ферментных препаратов, обеспечивает пролонгированное действие и повышает стабильность к денатурирующим факторам.

На данный момент особенно актуальны исследования, посвящённые структурно-функциональным свойствам белков соединительной ткани, включая коллаген и его производные. Коллаген является структурным белком внеклеточного матрикса, обладающий высокой биосовместимостью и способностью образовывать прочные комплексы с белковыми молекулами. Глюкоамилаза — важный фермент класса гидролаз (КФ 3.2.1.3.), катализирующий гидролиз крахмала и олигосахаридов до глюкозы.

Иммобилизация глюкоамилазы на коллагене может быть перспективной для разработки препаратов и покрытий с ферментативной активностью, в том числе для очистки ран и улучшения регенерации тканей.

Таким образом, изучение процессов иммобилизации глюкоамилазы на коллагене актуально не только с точки зрения создания новых ферментных комплексов с более стабильными характеристиками, но и составляет потенциал для медицинских технологий, открывает возможность создания биосенсоров на основе иммобилизованных ферментов, что значительно улучшает чувствительность и специфичность диагностики [1, 2].

Изучение особенностей взаимодействия глюкоамилазы с коллагеном и структурных изменений белковой молекулы при иммобилизации является важной задачей, имеющей практический и научный интерес.

Для исследования структуры комплекса коллаген-глюкоамилаза мы использовали инфракрасную спектроскопию (ИК). ИК-спектроскопия позволяет установить участие карбоксильных, ароматических, а также аминных групп в возникновении связей между коллагеном и глюкоамилазой, определяет характерные полосы поглощения, которые соответствуют колебаниям амидных групп (амид I и амид II), и, кроме того, валентным колебаниям NH- и OH-групп.

С помощью ИК-спектроскопиистановится возможным детально осуществлять анализ вторичной структуры белков, включая α-спирали, β-структуры и неупорядоченные участки, а также изменения интенсивности полос, связанных с образованием новых связей.

Полученные данные необходимы для выявления механизмов связывания глюкоамилазы с коллагеном, помогают оценить влияние иммобилизации на конформацию энзима и активного центра фермента, вклад водородных связей в стабилизацию комплекса, что крайне важно для разработки стабильных и эффективных биокатализаторов.

Материал и методы исследования. В качестве исследуемого образца использовали коммерческий образец глюкоамилазы (КФ 3.2.1.3.), полученной из Aspergillus awamori. Для получения высокоочищенного фермента использовали гель-хроматографию на сефадексе G-25, позволяющую эффективно удалять низкомолекулярные примеси.

В качестве субстрата в экспериментах использовали раствор крахмала (производитель компания «Экрос»), что обеспечивало стабильность и воспроизводимость результатов каталитических реакций.

Иммобилизацию энзима осуществляли с использованием биополимерного носителя - коллагена, полученного из соединительной ткани крупного рогатого скота. Получение и очистка биополимера производились на кафедре технологии продуктов животного происхождения Воронежского государственного университета инженерных технологий (ВГУИТ), что гарантировало его соответствие требованиям, предъявляемым к носителям ферментных препаратов [3].

Подробная характеристика использованных методов представлена ниже.

Методика сорбционной иммобилизации глюкоамилазы.

Иммобилизацию фермента проводили следующим образом: 5 г полимерного носителя инкубировали при 20-25 °С в 25,6 мл ацетатного буфера с рН 4,5. После образования устойчивой суспензии в систему вносили 5 мл раствора глюкоамилазы с молярной концентрацией 10⁻⁵ моль/л. Инкубацию проводили при постоянном перемешивании на электромешалке в течение 90 минут.

После завершения сорбции ферментной молекулы смесь подвергали центрифугированию (3000 об/мин, 5 минут), полученный осадок последовательно промывали ацетатным буфером (рН 4,5), а затем дистиллированной водой до устранения несвязанных белков. Контроль степени очистки проводили спектрофотометрически при длине волны 280 нм.

Количественное содержание белка в препарате иммобилизованной глюкоамилазы определяли с помощью модифицированного варианта метода Лоури. Оценку ферментативной активности проводили глюкозооксидазным методом с применением стандартного набора реагентов «Оксохром ГЛЮКОЗА С».

Определение содержания белка в препарате методом Лоури.

Метод Лоури основан на образовании окрашенных продуктов в результате реакции белков с определёнными химическими реагентами. На первом этапе происходит биуретовая реакция — взаимодействие пептидных связей с ионами меди(II) в щелочной среде, сопровождающееся формированием окрашенного комплекса синевато-фиолетового оттенка. Метод Лоури обладает высокой чувствительностью и является одним из наиболее распространённых подходов для количественного анализа белков.

Для анализа глюкоамилазы, закреплённой на твёрдом носителе, использовали адаптированную модификацию метода, предназначенную для определения белка, прочно ассоциированного с полимерной матрицей.

На начальном этапе разрушали связи между ферментом и коллагеновым носителем с целью перевода фермента в растворимую форму. Для этого образец обрабатывали раствором калий-натриевой соли тартратной кислоты на основе 1М NaOH при температуре 50 °C в течение 10 минут. Такие условия обеспечивали эффективное высвобождение белка при сохранении его нативной структуры.

Освобождённую белковую фракцию далее количественно определяли классическим методом Лоури. Полученные результаты использовались для расчёта степени иммобилизации фермента на коллагеновом носителе.

Глюкозооксидазный метод определения каталитической активности глюкоамилазы.

Активность глюкоамилазы определяли методом количественного измерения глюкозы, образующейся в результате ферментативного гидролиза крахмала. Анализ основан на реакции окисления β-D-глюкозы глюкозооксидазой с образованием глюконовой кислоты и перекиси водорода. Далее перекись водорода в присутствии пероксидазы вступает в реакцию с фенолом и 4-аминоантипирином, что приводит к формированию окрашенного комплекса. Интенсивность окрашивания фиксировали спектрофотометрически при длине волны 500 нм, пропорциональной концентрации глюкозы. Для проведения анализа использовали коммерческий набор реагентов «Оксохром ГЛЮКОЗА С», содержащий необходимые ферменты и субстраты.

 

Техника проведения анализа каталитической активности глюкоамилазы.

В пробирке готовили раствор фермента концентрацией 1 мг/мл в дистиллированной воде. К нему добавляли 2 мл 1%-ного раствора крахмала, растворённого в ацетатном буфере с рН 4,7. Реакционную смесь инкубировали при 37 °C в термостате в течение 10 минут. По окончании инкубации пробирки помещали в кипящую водяную баню на 2 минуты для инактивации фермента, затем охлаждали до комнатной температуры.

Определение концентрации глюкозы.

Из каждой пробирки отбирали по 10 мкл гидролизата, который смешивали с 2 мл рабочего реагента из набора «Оксохром ГЛЮКОЗА С». Смесь тщательно перемешивали и инкубировали при температуре 20-25 °C в течение 30 минут или при 37 °C  в течение 15 минут. После инкубации оптическую плотность образцов измеряли на спектрофотометре Шимадцу RF-5301 PC при длине волны 500 нм. Для калибровки использовали пробу, содержащую 2 мл рабочего реагента и 0,01 мл стандартного раствора глюкозы, а контрольную пробу составлял только рабочий реагент без образца.

Расчет концентрации и каталитической активности глюкозы.

Концентрацию глюкозы рассчитывали по формуле:

С=Dο/Dст·10 (моль/л),

где Dο и Dст – оптические плотности образца и стандарта, измеренные относительно контрольной пробы.

Каталитическую активность глюкоамилазы (A) определяли по формуле:

 ,

где а - количество глюкозы, образовавшейся в 1 мл гидролизата, мкг;
b - количество фермента в 1 мл гидролизата, мг/мл; t - время гидролиза, мин;
180 - молекулярная масса глюкозы.

Подготовка исследуемых образцов к анализу методом ИК-спектрофотометрии.

Метод инфракрасного спектрального анализа широко используется для исследования структуры биополимеров, в том числе белков и ферментов. Для получения высококачественных спектров поглощения необходимо предварительно подготовить исследуемые образцы, что включает высушивание, измельчение, смешивание с матрицей (бромистым калием, KBr) и прессование в таблетку.

Подготовка бромистого калия (KBr) в качестве матрицы. Бромистый калий (KBr) является наиболее часто используемым материалом для получения таблеток в ИК-спектроскопии из-за его высокой прозрачности в инфракрасном диапазоне. Монокристаллический KBr подвергали предварительному механическому измельчению с использованием вибрационного мельничного устройства Ардена-Фирша (Германия). Измельченный порошок помещали в сушильный шкаф и выдерживали при температуре 200 °C в течение 48 часовдля полного удаления следов влаги. Проверку чистоты KBr проводили методом ИК-спектроскопии путем записи контрольного спектра – отсутствие полос поглощения указывало на чистоту и полное удаление влаги. Подготовленный порошок хранили в герметично закрытых бюксах, помещенных в эксикатор для предотвращения повторного увлажнения.

Подготовка ферментного образца. Для исследования использовали фермент глюкоамилазу, который предварительно подвергали сушке для удаления влаги и обеспечения равномерного распределения в матрице:образцы фермента высушивали при 37 °C до постоянной массы, чтобы исключить влияние свободной воды на спектральные характеристики.Высушенный образец фермента затем подвергали механическому измельчению в вибрационной мельнице Ардена-Фирша для получения мелкодисперсного порошка.

Приготовление смеси KBr и ферментного образца.

Для получения однородной смеси взвешивали 1,5 мг ферментаи 150 мг предварительно подготовленного KBr.Компоненты тщательно перемешивали в мельнице Ардена-Фирша в течение 10 минут для равномерного распределения фермента в матрице.

Прессование таблеток для ИК-спектроскопии.Для подготовки таблеток отбирали 100 мг подготовленной смеси, равномерно распределяли в пресс-форме и подвергали прессованию при давлении 150 кг/см² в течение 30 минут. Полученные таблетки извлекали и проверяли на однородность и отсутствие дефектов.

Измерения ИК-спектров проводили с помощью спектрофотометров Specord M-80 (Германия) и Vertex-70 в диапазоне 4000–400 см⁻¹. Спектры подвергали сглаживанию для снижения шумов. Анализ полос поглощения осуществляли с помощью автоматической обработки, включая вычисление второй производной спектра для выявления скрытых пиков. Минимумы, присутствующие во всех спектрах, считались достоверными, тогда как появляющиеся лишь в отдельных спектрах — отнесены к шуму.

Все реально существующие полосы фиксировали и анализировали. В случае их стабильности в серии экспериментов фиксировали среднее значение параметров. Если параметры изменялись, зависимость от состава системы аппроксимировали гладкой кривой для определения закономерностей взаимодействия фермента с носителем.

Для повышения достоверности результатов все эксперименты проводились с 4-5 кратной повторностью. Повторные измерения позволяли снизить влияние случайных погрешностей и оценить воспроизводимость данных.

Статистическая обработка результатов осуществляли с применением пакета прикладных статистических программ, с расчетом средних значений, стандартных отклонений и проверки значимости различий с использованием соответствующих критериев.

Для определения значимости различий между контрольными и опытными группами использовали t-критерий Стьюдента, при уровне значимости p ≤ 0,05 (95 % доверительный интервал).

Полученные результаты и их обсуждение. В рамках исследования была осуществлена адсорбционная иммобилизация глюкоамилазы на коллагеновом носителе, выделенном из соединительной ткани крупного рогатого скота.

Установлено, что наиболее активное связывание фермента происходит в начальной фазе процесса, при этом состояние сорбционного равновесия достигается спустя 1,5 часа инкубации. Максимальная сорбционная емкость системы составила 20 мг фермента на 1 г носителя.

Выявлены оптимальные условия для эффективного связывания фермента, включая концентрацию ионов водорода и температуру среды. Установлено, что максимальная сорбция достигается при pH 4,5, что объясняется доминированием цвиттер-ионной формы фермента в данных условиях, способствующей его взаимодействию с коллагеновой матрицей. Оптимальный pH способствует сохранению структуры активного центра фермента. При изменении pH могут изменяться заряды на аминокислотных остатках активных участков фермента, что влияет на его способность к связыванию с субстратом и носителем.Определение наилучшего pH также способствует максимальной сорбции фермента на носитель, поскольку связывание между ферментом и носителем может зависеть от ионного состояния белка [4].

Оптимизация температурного режима при иммобилизации глюкоамилазы может значительно повлиять на стабильность энзима и его сорбционные свойства, а также каталитическую активность. Установлено, что оптимальная температура для адсорбции глюкоамилазы составляет 50 °C. Повышение температуры больше 50°C вызывает денатурацию белковой структуры, что приводит к разрушению активного центра и соответственно снижению эффективности сорбции. Оптимальная температура обеспечивает эффективное взаимодействие с субстратом вследствие улучшенной подвижности активных участков белка.

По результатам проведённых экспериментов установлено, что наибольшая эффективность сорбционной иммобилизации глюкоамилазы на коллагеновом носителе, полученном из соединительной ткани крупного рогатого скота, достигается при температуре 50 °C и pH 4,5 [5].

ИК-спектроскопия — это мощный и универсальный инструмент для изучения структурных изменений, молекулярных взаимодействий и стабильности ферментов, который может быть использован в сочетании с другими методами для более глубокой оценки качества и эффективности иммобилизованных ферментов. ИК-спектроскопияоснована на исследовании колебания химических связей в молекулах (особенно в области амидных связей, водородных связей и гидрофобных взаимодействий), что позволяет анализировать структурные изменения в ферменте и его взаимодействие с носителем. Она помогает выявить изменения во вторичной итретичной структуре белков [6].

Для изучения структуры иммобилизованного ферментного комплекса применялась ИК-спектроскопия (рис. 1).

Рис. 1. ИК-спектры коллагена, свободной и иммобилизованной глюкоамилазы.
1 - коллаген; 2 - глюкоамилаза; 3 - глюкоамилаза, иммобилизованная на коллагене

 

При анализе ИК-спектров глюкоамилазы отмечена характерная полоса поглощения в диапазоне 3070–3300 см⁻¹, связанная с валентными колебаниями
NH-групп белковой молекулы. После сорбционной иммобилизации фермента на коллагене наблюдается возникновение новых сигналов и изменение интенсивности полос в области 3423 см⁻¹, что может отражать перестройку водородных связей и изменение доступности аминогрупп. Данные спектральные сдвиги свидетельствуют о взаимодействиях глюкоамилазы с матрицей носителя, включая формирование новых межмолекулярных водородных связей, способствующих стабилизации структуры фермента в иммобилизованном состоянии.

Важную роль в структурной организации иммобилизованных ферментов играет образование водородных связей. В ИК-спектре фиксируется интенсивная полоса в диапазоне 3400–3200 см⁻¹, указывающая на формирование водородных связей, что, по всей вероятности, обусловлено взаимодействием функциональных групп глюкоамилазы с коллагеном. Кроме того, усиление поглощения в области 3200–2500 см⁻¹ для иммобилизованного фермента свидетельствует о формировании внутрикомплексных соединений, вероятно, с участием амидных и гидроксильных групп. Эти спектральные изменения подтверждают перераспределение межмолекулярных взаимодействий в процессе иммобилизации, что может сказываться на стабильности и каталитической активности фермента в связанном состоянии.

В ходе исследования было выявлено, что при иммобилизации глюкоамилазы на коллагеновом носителе наблюдаетсявыраженноесмещение и расширение пиков в область более высоких частот, и, кроме того, увеличение интенсивности полос амидных групп I (1565–1530 см⁻¹) и II (1699–1619 см⁻¹). Подобные спектральные изменения, возможно, определяются увеличением числа водородных связей, что приводит к стабилизации вторичной структуры фермента в иммобилизованном состоянии.

Наблюдаемое перераспределение элементов вторичной структуры, включая
α-спиральные фрагменты, β-слои и неупорядоченные участки, подтверждает влияние иммобилизации на пространственную организацию белковой молекулы. Результаты исследования свидетельствуют о том, что основным механизмом связывания глюкоамилазы с коллагеновой матрицей является формирование водородных связей, что способствует устойчивости фермента в иммобилизованном состоянии.

Иммобилизация глюкоамилазы сопровождается заметными изменениями в
ИК-спектре, проявляющимися в перестройке спектральных характеристик в диапазоне 3300–2500 см⁻¹. Выраженные пики при 2856, 2918 и 2954 см⁻¹ отражают участие гидроксильных групп в формировании водородных связей -OH-групп. Эти изменения свидетельствуют о возможных взаимодействиях между функциональными группами фермента и коллагенового носителя, что может способствовать формированию устойчивой белково-матричной структуры. Данные спектральные особенности подтверждают вклад водородных связей в процесс иммобилизации, вследствие чего возможно изменение конформации и функциональной активности фермента в связанном состоянии.

При иммобилизации глюкоамилазы на коллагене в ИК-спектре наблюдаются изменения интенсивности полос поглощения в диапазоне 900–690 см⁻¹. Эти характерные частоты могут отражать участие ароматических аминокислотных остатков, таких как фенилаланин (Phe) и триптофан (Trp), в формировании гидрофобных взаимодействий между белком и носителем. Кроме того, вероятно, что тирозиновые остатки вовлечены в образование водородных связей, способствуя стабилизации структуры иммобилизованного фермента. Эти спектральные изменения указывают на значительный вклад гидрофобных и специфических нековалентных взаимодействий в процесс закрепления фермента на коллагеновой матрице, что может оказывать влияние на его пространственную организацию и каталитическую активность.

В ИК-спектрах анализируемых образцов регистрируются полосы поглощения в диапазоне 1000–1075 см⁻¹, соответствующие колебаниям карбоксильных (-COOH) и карбонильных (-CO-) групп. Существенное усиление интенсивности этих полос в спектре иммобилизованного фермента может свидетельствовать об изменении химической природы микроокружения активных групп, участвующих во взаимодействии с носителем. Такое увеличение интенсивности полос может быть связано с образованием новых межмолекулярных контактов, включая водородные связи или электростатические взаимодействия, что предопределяет возможные измененияв пространственной организации глюкоамилазы и ее функциональных свойствах после иммобилизации.

Иммобилизация глюкоамилазы на коллагеновом носителе сопровождается изменениями в ИК-спектре, проявляющимися в трансформации формы и интенсивности полос поглощения в областях 3000–2800 см⁻¹ и 1049 см⁻¹, соответствующих колебаниям, характерным для алифатических аминокислотных остатков. Эти спектральные сдвиги могут свидетельствовать о реорганизации гидрофобных областей фермента при взаимодействии с носителем. Вероятно, происходит уплотнение гидрофобного ядра белка, что изменяет его структурную подвижность и доступность активного центра. В результате такого перераспределения внутримолекулярных взаимодействий возможно снижение каталитической активности глюкоамилазы после иммобилизации, что требует дальнейшего изучения для оптимизации условий закрепления фермента на коллагеновой матрице.

Согласно данным C. Gullekson, L. Lucas, K. Hewitt и L. Kreplak, полученным с использованием рамановской спектроскопии, установлено, что при взаимодействии коллагена с поверхностями, покрытыми тонкими слоями серебра (Ag) и золота (Au), происходят структурные изменения, отражающиеся в характере спектральных полос. Ключевую роль в формировании межмолекулярных взаимодействий играют ароматические аминокислотные остатки, такие как фенилаланин и тирозин. Эти группы способны участвовать в специфических взаимодействиях, включая π-π стеккинг и водородные связи, что оказывает влияние на структурные и функциональные свойства коллагена. Полученные данные подтверждают значимость ароматических аминокислот в процессах адсорбции и взаимодействия белковых молекул с различными материалами, что может быть учтено при разработке биосовместимых носителей и биоматериалов [7, 8].

Выводы. На основе полученных данных ИК-спектроскопии для свободной и иммобилизованной на коллагене формы фермента, можно сделать несколько ключевых выводов о механизме взаимодействия между энзимом и носителем. Результаты ИК-спектроскопического анализа свидетельствуют о том, что адсорбционная иммобилизация глюкоамилазы на коллагене происходит за счёт взаимодействия с функциональными группами аминокислотных остатков на поверхности носителя. В процесс вовлечены как положительно, так и отрицательно заряженные, а также полярные и гидрофобные участки. Установлено, что связывание обеспечивается совокупностью водородных связей, ионных и гидрофобных взаимодействий, которые способствуют стабилизации фермента на поверхности коллагена, что может влиять на его структуру и активность. Таким образом, данные показывают, что как физико-химические характеристики поверхности носителя, так и специфические аминокислотные остатки глюкоамилазы играют важную роль в процессе иммобилизации, определяя не только эффективность этого процесса, но и функциональные свойства фермента после иммобилизации.

About the authors

Ekaterina Leonidovna Makarova

N.N. Burdenko Voronezh State Medical University of the Russian Ministry of Health

Author for correspondence.
Email: makkat2020@mail.ru

PhD, Associate Professor of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics

Russian Federation, 394036, Russia, Voronezh, Studencheskaya Street, 10

Oksana Mikhailovna Kozhokina

N.N. Burdenko Voronezh State Medical University of the Russian Ministry of Health

Email: omkozhokina@mail.ru

PhD, Associate Professor of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics

Russian Federation, 394036, Russia, Voronezh, Studencheskaya Street, 10

References