Comparison of the effect of local application of lactoferrin solution on the cytokine and antioxidant status of the cornea in its thermal and alkaline burns

Full Text

Актуальность. Роговица входит в состав оптической системы глаза и составляет около 80% его преломляющей способности. У роговицы существует система антиоксидантной защиты, состоящая из ферментного и неферментного звена. Неферментное звено представлено аскорбиновой кислотой, глутатионом, жирорастворимыми витаминами. В первичное ферментативное звено входят супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, каталаза (CAT) и пероксиредоксины, во вторичное - транскетолаза (TKT), глюкозо-6- фосфатдегидрогеназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, глутатионсинтетаза, глутатионредуктаза [1]. Патологические процессы в роговице приводят к снижению ее прозрачности и ухудшению зрения.

Повреждающие факторы, приводящие к ожогам роговицы, подразделяются на термические, химические и лучевые. Большой процент ожогов глаз приходится на химические ожоги глаз лиц мужского пола трудоспособного возраста [2].

Под воздействием щелочи развивается колликвационный некроз [3]. Происходит усиленное образование свободных форм кислорода, которые вызывают окислительный стресс в клетках, приводящий к перекисному окислению липидов, окислительному повреждению ДНК и денатурации белков протеогликанов и коллагена стромы [4]. Наблюдается снижение активности и содержания антиоксидантных ферментов, что приводит к снижению антиоксидантной защиты роговицы.

При термических ожогах повреждение тканей происходит высокотемпературным источником, при этом развивается коагуляционный некроз, который предотвращает более глубокое повреждение [5].

Не всегда лечение ожогов роговицы приводит к ожидаемому результату, поэтому в настоящее время все большее внимание уделяется изучению цитокинового и свободнорадикального статуса роговицы. От баланса провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и от выраженности окислительного стресса зависит исход заболевания. При чрезмерном повышении провоспалительных цитокинов и активации свободнорадикальных процессов возможно развитие перфорации роговицы, а при слабом - происходит хронизация процесса и чрезмерное развитие соединительной ткани [6].

Изучение роли соразмерности уровня цитокинов выраженности окислительного стресса при развитии термических и химических ожогов позволит обосновать действие веществ, влияющих на процесс регенерации роговицы при данных поражениях. Особый интерес представляет лактоферрин.

Проведенные нами ранее исследования показали, что местное применение раствора лактоферрина при щелочных ожогах способствовало более быстрой регенерации эпителия и восстановлению структуры стромы роговицы кролика, профилактировало развитие осложнений (перфораций), оказывало антиоксидантное действие [7].

При термическом ожоге применение лактоферрина так же приводило к ускорению заживления дефекта, профилактике развития осложнений, снижению выраженности окислительного стресса, но в исходе было выявлено более грубое помутнение роговицы [8].

Важным представляется сравнение влияния раствора лактоферрина на щелочные и термические ожоги, выявление причины чрезмерного разрастания соединительной ткани при термических ожогах и отсутствие данного негативного для прозрачности роговицы влияния при щелочных ожогах.

Сравнения влияния местного применения раствора лактоферрина на показатели цитокинового и антикосидантного статуса роговицы при ее термических и щелочных ожогах является актуальной проблемой биохимии и офтальмологии, решение которой позволит расширить представления о молекулярных механизмах данных патологий и разработать подходы их коррекции.

Материал и методы исследования. В работе использован экспериментальный материал, полученный от 96 кроликов. Протокол исследования рассмотрен и одобрен на заседании комиссии по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России (выписка №17 от 07.11.2018). Работу с животными проводили в соответствии с международными правилами (Директива 86/609/ЕЕС) и правилами надлежащей лабораторной практики (приказ МЗ РФ No199н от 01.04.16). Манипуляции на глазных яблоках проведены под топической анестезией 0,4% оксибупрокаина.

Животные были разделены на 3 группы. В первой моделировали щелочной ожог роговицы, лечение проводили лактоферрином (n = 21); во второй моделировали термический ожог, лечение проводили лактоферрином (n = 21). Третья группа – интактные животные (n = 6).

Животные выводились из эксперимента через 1, 3, 5, 7, 14, 21 и 28 сутки, по 3 кролика в каждый срок наблюдения (6 глаз, n = 6).

Моделировали щелочной [8] и термический [9] ожоги роговицы 3 степени по разработанным ранее методикам.

Биохимические методы: определение концентрации ТБК-активных продуктов [10], концентрации карбонильных производных белков [11], активность супероксиддисмутазы [12], активность глутатиопероксидазы [13], определение концентрации интерлейкина (IL) IL-1β, IL-4, IL-10, TNF-1а, TGF-1β.

Характер распределения количественных переменных оценивался с помощью критерия Шапиро-Уилка. Так как во всех случаях распределение данных было отличным от нормального, результаты в таблицах и на графиках представлены в медианы Me (Q1; Q3),14где Me – медиана, Q1 – нижний (25%) квартиль, Q3 – верхний (75%) квартиль, а для оценки статистической значимости применялись непараметрические критерии – при сравнении более чем двух групп критерий Крускалла-Уоллиса, в дальнейшем попарные сравнения выполнялись с помощью критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферрони.

При вероятности ошибки первого рода (p) < 0,05 различия между группами считались статистически значимым.

Полученные результаты и их обсуждение. В обеих группах происходило достоверное (p<0,05) повышение уровня ТБК-реактивных продуктов реакций с 1 по 14 сутки исследования (табл. 1). При щелочных ожогах роговицы изменения были более выраженными, пиковые значения отмечались на 14 сутки эксперимента, на 119,2% от значений интактных (p<0,05). При термических ожогах повышение уровня ТБК-реактивных продуктов реакций на 1 и 3 сутки было достоверно (p<0,05) выше, чем в группе щелочных ожогов, максимальное значение показателя было зафиксировано на 5 сутки (75,5% от уровня интактных животных (p<0,05)), нормализация показателя в группе термического ожога произошла на 21 сутки. На 28 сутки значение показателя в обеих группах было даже ниже нормы (для щелочных ожогов на 11,35% (p<0,05); для термических ожогов - 7,9% от значений нормы (p<0,05)).

За одну условную единицу активности [ЕА] принимали 50–процентное ингибирование аутоокисления кверцетина.

В группе щелочных ожогов активность SOD на 5, 7 и 14 сутки снижалась на 42%, 22,4%, 19,9% (p<0,05) от уровня интактных животных соответственно, а далее достоверно от значений нормы не отличалась, а при термических ожогах – на 1 и 5 сутки на 8,3%, 33,3% от уровня интактных животных (p<0,05).

Активность GPX в группе щелочных ожогов снижалась только на 7 и 14 сутки на 21,7% и 15,65% относительно группы интактных животных (p<0,05). В группе термических ожогов уровень GPX достоверно не отличался от показателей группы интактных животных на всех сроках наблюдения (табл.1).

Таблица 1 – Влияние Лактоферрина на свободнорадикальный статус роговицы при щелочном и термическом ожоге, M[Q₁-Q₃]

Вид ожога	Сутки эксперимента
	1	3	5	7	14	21	28
ТБК-реактивные продукты, нмоль/мг белка;
значение в группе интактных животных 2,29 [2, 18–2, 35]
Щелочной	2,86 [2, 31–3, 01]	3,46 [3, 04–3, 87]*	4,53 [4, 37–4, 6] *	4,87 [4, 54–5, 09]*	5,02 [4, 7– 5, 3] *	3,81 [3, 54–3, 95]*#	2,03 [1, 81–2, 23]
Термический	3,69 [3, 29–4, 28]*#	3,84 [3, 26–4, 2]*	4,02 [3, 95–4, 04]*	3,28 [3, 05–3, 62]*#	2,46 [2, 43–2, 49]#	2,27 [2, 14–2, 45]#	2,11 [2, 08–2, 16]
SOD, ЕА/мг белка; значение в группе интактных животных 3,12 [3, 07–3, 14]
Щелочной	3,0 [2, 92–3, 13]	2,78 [2, 62–2, 99]*	1,81 [1, 71–1, 99]*	2,42 [2, 37–2, 51] *	2,5 [2, 37–2, 53] *	2,96 [2, 79–3, 12]	3,14 [3, 1–3, 16]
Термический	2,86 [2, 8–2, 9]*	1,94 [1, 76–2, 83]	2,08 [1, 98–2, 12]*	2,66 [2, 56–2, 74]	2,77 [2, 67–2, 83]	2,9 [2, 77–3, 05]	3,12 [3, 07–3, 13]
GPX, нмоль НАДФН/ мин/ мг белка; значение в группе интактных животных 19,36 [17, 88–23, 19]
Щелочной	23,22 [23, 07–23, 39]	20,12 [19, 75–20, 67]	18,32 [16, 09–19, 47]	15,15 [14, 19–17, 21]*	16,33 [12, 4–17, 76]*	22,67 [19, 83–23, 89]*	21,17 [20, 74–22, 41]
Термический	22,83 [22, 36–23, 84]	22,01 [17, 95–23, 85]	18,82 [16, 34–22, 17]	17,32 [17, 25–17, 41]	18,44 [17, 2–18, 99]	23,24 [21, 92–23, 76]	23,61 [21, 19–24, 11]
Карбонильные производные белков, нмоль/мг белка; значение в группе интактных животных 3,16 [2, 93–3, 2]
Щелочной	5,69 [5, 57–5, 71] *	5,05 [5, 0–5, 11] *	4,06 [3, 94–4, 08] *	2,13 [2, 08–2, 35] *#	2,03 [2, 0–2, 13] *#	2,5 [2, 4–2, 63]*	2,92 [2, 76–2, 98] #
Термический	2,68 [2, 15–3, 16]#	3,64 [3, 38–4]#	4,3 [3, 94–4, 59]	3,59 [3, 06–3, 73]#	2,49 [2, 43–2, 55]*#,	2,61 [2, 448–2, 843]	2,02 [1, 95–2, 14]#

* – p < 0,05 статистически значимые различия с показателями группы интактных животны; #– p < 0,05 статистически значимые различия между группами.

 

Уровень карбонильных производных белков при щелочном ожоге возрастал на 1, 3, 5 сутки на 80,06%, 59,81%, 28,48% (p<0,05) от значений интактных животных соответственно, а с 7 по 14 сутки был ниже значений интактных животных на 32,59% и 35,76% (p<0,05) соответственно. При термических ожогах повышение уровня показателя на 36,08% (p<0,05) от значений интактных животных наблюдалось только на 5 сутки эксперимента. На 1, 7 и 28 сутки уровень карбонильных производных белков был достоверно (p<0,05) ниже на 15,19%, 3,61%, 36,08% соответственно, а на 14 - на 22,66% (p<0,05) выше, чем в группе щелочных ожогов.

Результаты изучения влияния лактоферрина на цитокиновый статус роговицы представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Влияние Лактоферрина на цитокиновый статус роговицы при щелочном и термическом ожоге, M[Q1-Q3]

Вид ожога	Сутки эксперимента
	1	3	5	7	14	21	28
TNF–1α, пг/мг белка;
значение в группе интактных животных 120,19 [109, 36–123, 73]
Щелочной	300,07 [297, 26–303, 54] *	217,84 [213, 72–225, 47] *	180,55 [176, 38–186, 56]*	180,72 [171, 16–184, 18] *	221,19 [210, 35–229, 52] *	219,95 [208, 93–234, 47] *	199,43 [190, 16–213, 73]*
Термический	255,53 [238, 38–258, 67]* #	285,53 [271, 07–299, 95]* #	295,63 [287, 45–310, 57]*,#	362,76 [345, 93–368, 91]*#	273,32 [257, 35–304, 13] #	270,07 [255, 75–282, 03]* #	248,81 [233, 48–250, 45]*#
IL–4, пг/мг белка; значение в группе интактных животных 39,78 [36, 65–41, 09]
Щелочной	38,61 [37, 69–39, 28]	42,29 [39, 92–43, 05]	41,11 [38, 44–42, 46]*	37,75 [36, 89–38, 45]	28,17 [27, 59–28, 9]*	30,86 [30, 41–32, 05] *	33,0 [31, 64–34, 42]*
Термический	48,23 [47, 93–50, 81] #	39,23 [38, 52–40, 89]	43,35 [42, 76–44, 25]	32,96 [31, 29–34, 23] #	40,60 [39, 11–41, 15]#	42,37 [42, 14–42, 98]#	41,87 [41, 56–43, 88]#
IL–10, пг/мг белка; значение в группе интактных животных 6,21 [5, 59–6, 3]
Щелочной	12,65 [12, 39–12, 71]*	12,73 [11, 93–13, 06]*	16,28 [15, 98–16, 52]*	10,83 [10, 19–11, 21]*	11,53 [11, 01–11, 84] *	9,32 [9, 26–9, 37]*	7,707 [7, 43–8, 31]*
Термический	7,34 [7, 19–7, 56] #	6,00 [5, 46–6, 38]#	9,35 [8, 13–10, 39]*,#	8,02 [7, 83–8, 14]*,#	9,79 [9, 10–10, 30]*,#	10,94 [8, 61–12, 07]*,#	13,20 [12, 00–13, 46]*,#
TGF–1β, пг/мг белка; значение в группе интактных животных 34,57 [34, 21–36, 15]
Щелочной	42,67 [41, 74–43, 43]*	38,20 [36, 17–38, 60]	44,11 [42, 94–46, 29] *	68,5 [68, 39–68, 78] *	61,91 [61, 36–62, 36] *	53,27 [52, 96–53, 56] *	49,32 [48, 96–50, 5] *
Термический	58,47 [57, 59–59, 83]*#	79,77 [79, 21–80, 25]*,#	93,76 [88, 31–99, 03]*,#	94,87 [89, 40–102, 23]*,#	60,92 [52, 71–63, 65]*	61,09 [53, 61–68, 53]*	61,44 [58, 98–63, 64]*,#

*– p < 0,05 статистически значимые различия с показателями группы интактных животных.

 #– p < 0,05 статистически значимые различия между групп.

 

Уровень TNF-1α достоверно превышал показатели интактных животных в обеих группах на протяжении всего эксперимента. В группе щелочных ожогов максимальный уровень показателя наблюдался на первые сутки эксперимента (на 149,7% выше от значений интактных животных (p<0,05)), с третьих суток значения показателя в группе термического ожога была выше, чем в группе щелочного, максимальные значения наблюдались на 7-е сутки, превышая показатель интактных животных на 201,8% (p<0,05) (табл.2).

Уровень IL–4 в группе щелочного ожога был достоверно выше значений интактных животных на 5 сутки (на 3,3% (p<0,05)) и ниже значений интактных животных на 14, 21, 28 сутки на 29,2%, 22,4%, 17% (p<0,05) соответственно. А в группе термического - повышался относительно уровня интактных животных на 5 сутки на 9% (p<0,05), а с 14 по 28 сутки был достоверно ниже значений интактных животных на 2,1%, 6,5%, 5,25% соответственно. На 1, 14, 21 и 28 сутки значения группы термического ожога достоверно (p<0,05) превышали значения группы щелочного ожога на 25%, 44,1%, 37,3%, 26,9% соответственно. А на 7 сутки - были ниже значения группы щелочного ожога на 12,7% (p<0,05).

Уровень IL–10 в группе щелочного ожога был выше значений интактных животных на всех сроках наблюдения, достигая максимума на 5 сутки (на 162,2% от значений интактных животных) (p<0,05). В группе термического ожога повышение показателя было менее выраженным: он повышался на 1 и 5 сутки развития патологии (на 18,2% и 50,6% соответственно), а с 7 по 28 сутки наблюдался рост показателя, Максимальное значение показателя пришлось на 28 сутки (на 112,6% от от значений интактных животных (p<0,05)).

Уровень TGF-1β был повышен в обеих группах на всех сроках эксперимента, а на 1, 3, 5, 7, 21, 28 сутки уровень TGF-1β в группе термического ожога достоверно (p<0,05) превышал значения группы щелочного ожога на 37%, 108,8%, 112,6%, 38,5%, 14,7%, 24,6%.

В качестве вещества, используемого для коррекции цитокиновых и свободнорадикальных нарушений роговицы, в данном исследовании применялся лактоферрин - эндогенный белковый компонент слезной жидкости. Лактоферрин ускоряет заживление повреждения и профилактирует развитие осложнений, например, перфорация роговицы, характеризуется наличием антибактериального действия, антиоксидантной активности [14] (способен связывать железо, блокируя развитие реакций Фентона и Хабер-Вайса [15]; понижает уровень карбонильных производных белков и ТБК-реактивных продуктов), может оказывать иммуномодулируюшее действие, влияя на баланс цитокинов(повышает уровень противовоспалительных цитокинов IL-4, IL-10 или провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, TNF-1a) [16], а также ингибирует матриксные металлопротеазы, участвующие в регенерации роговицы, что может привести к формированию более грубого рубца.

В проведенном нами исследовании течение щелочных ожогов характеризовалось более интенсивным, но более поздним истощением пула антиоксидантов и повышения уровня ТБК-активных продуктов реакций в роговице. Максимальные значения ТБК-активных продуктов при щелочных ожогах фиксировались на 14 сутки эксперимента, а при термических - на 5. Активность SOD при щелочных ожогах снижалась с 3 по 14 сутки (на 10,9%, 42%, 22,4%, 19,9% относительно группы интактных животных), а при термических – уже на 1 сутки развития патологии. Активность GPX при щелочных ожогах была снижена на 7 и 14 сутки, а при термических - не отличалось от показателей интактных животных на протяжении всего эксперимента.

При изучении влияния лактоферрина на цитокиновый статус роговицы были получены следующие результаты.

Уровень TNF-1α достоверно превышал показатели группы интактных животных в обеих группах на протяжении всего эксперимента, достигая максимума при щелочных ожогах на 1 сутки, а при термических – на 7. При этом, уровень TNF-1α при термических ожогах был достоверно выше, чем при щелочных с 3 по 28 сутки.

Уровень IL–4 в группе щелочного ожога был ниже, чем при термических ожогах с 14 по 28 сутки. А на 7 сутки - выше значения группы щелочного ожога.

Уровень IL–10 в группе щелочного ожога был выше уровня интактных животных на всех сроках наблюдения, достигая максимума на 5 сутки. В группе термического ожога повышение показателя менее выраженным, однако, наблюдался более поздний рост показателя, который привел к тому, что на 21, 28 сутки значения группы термического ожога превосходили значения щелочного ожога.

Уровень TGF-1β был повышен в обеих группах, а на 1, 3, 5, 7, 21, 28 сутки уровень TGF-1β в группе термического ожога достоверно превышала значения группы щелочного ожога.

Следовательно, при термическом ожоге лактоферрин вызвал более быстрое восстановление роговицы, но при этом привел к разрастанию соединительной ткани к 28 суткам.

Выводы. Местное применение раствора Лактоферрина оказывает положительное влияние на восстановление показателей цитокинового и антиоксидантного статусов роговицы при ее ожогах. К 28 суткам показатели антиоксидантного статуса роговицы в обеих группах были в пределах нормальных значений. Показатели цитокинового статуса роговицы на 28 сутки превышали показатели группы интактных животных.

При термическом ожоге наблюдалось большее повышение уровней TGF-1β и TNF-1α, что могло привести к формированию более грубых помутнений в исходе эксперимента.

About the authors

Alexander Vyacheslav Kolesnikov

Ryazan State Medical University of the Ministry of Health of Russia;
State Budgetary Institution of the Rostov Region "N.A. Semashko Regional Clinical Hospital"

Author for correspondence.
Email: kolldoc@mail.ru

Doctor of Medical Sciences, Associate Professor, Head of the Department of Eye Diseases; Head of 2nd Ophthalmology Department

Russian Federation, 390026, Russia, Ryazan, Vysokovoltnaya Street, 9; 390005, Russia, Ryazan, Semashko Street, 3.

Irina Vladimirovna Kirsanova

Ryazan State Medical University of the Russian Ministry of Health;
State Budgetary Institution of the Rostov Region "N.A. Semashko Regional Clinical Hospital"

Email: kirsanova-iv@inbox.ru

Assistant Professor of the Department of Eye Diseases; Ophthalmologist at the 2nd Ophthalmological Department

Russian Federation, 390026, Russia, Ryazan, Vysokovoltnaya Street, 9; 390005, Russia, Ryazan, Semashko Street, 3.

Elizabetha Romanovna zilina

Ryazan State Medical University of the Ministry of Health of Russia

Email: lisazhilina@yandex.ru

student

Russian Federation, 390026, Russia, Ryazan, Vysokovoltnaya Street, 9

Svetlana Alekseevna Mokhova

Ryazan State Medical University of the Ministry of Health of Russia

Email: svetlanamohova2000@gmail.com

ordinator

Russian Federation, 390026, Russia, Ryazan, Vysokovoltnaya Street, 9

References