In silico and in vivo studies of the effect of N-(het)arylamides of 4-aryl-2,4-dioxobutanoic acid with a pyrimidine fragment on muscle tone and motor coordination in animals

Full Text

Актуальность. При разработке лекарственных средств одним из важных требований фармакологической безопасности является необходимость экспериментальной оценки потенциальных нейротоксичных эффектов. Развитие неврологического дефицита, сопровождающееся нарушениями нервно-мышечного поведения, оценивают при помощи целого ряда клинико-функциональных тестов. В свою очередь, изучение аспектов воздействия потенциальных субстанций, связанных с двигательной функцией, позволяет прогнозировать терапевтический эффект при нейродегенеративных заболеваниях, в том числе при мышечных дистрофиях, миопатиях, болезни Паркинсона и других, при которых наблюдается значительное снижение качества жизни пациентов: ограничение двигательной активности и, в ряде случаев, последующая инвалидизация. Несмотря на широкую распространенность нервно-мышечных патологий, особенно среди пожилого населения, варианты радикальных методов лечения отсутствуют [1, 2], а современные подходы к терапии в основном направлены на замедление прогрессирования заболевания и улучшение симптоматики, однако не позволяют полностью восстановить мышечную функцию. Учитывая вышесказанное, проблема поиска лекарственных препаратов, воздействующих на новые молекулярные звенья патогенеза миопатий [3] является актуальной, а использование ряда общетоксикологических фармакологических тестов позволяет оценить не только профиль безопасности, но и потенциал проявления нейропротекторной активности, улучшения мышечного тонуса.

Ранее ряд синтезированных соединений на основе 4-(гет)арил-2-гидрокси-4-оксобут-2-еновых кислот с фрагментами пиримидина и бензимидазола показал наличие нейропсихотропной активности [4, 5], что позволило сделать вывод о наличии анксиолитического профиля действия у некоторых веществ. Это послужило предпосылкой к последующему применению компьютерного моделирования для прогноза и поиска высокоактивных веществ среди производных данного ряда, их синтезу и изучению влияния полученных веществ на поведенческие реакции животных, в первую очередь показатели двигательной активности.

Материал и методы исследования. Объектом исследования являлись 5 новых гетариламидов 4-(гет)арил-2-гидрокси-4-оксобут-2-еновых кислот с фрагментами пиримидина (PV-150, PV-210, PV-220 PV-310, PV-410).

Исследование in silico включало компьютерное прогнозирование биологической активности, которое осуществляли с помощью программы PASS Online. Прогноз взаимосвязей «структура-активность», проводили по следующим критериям - вероятность проявления активности Pa и отношение вероятности проявления активности к вероятности ее отсутствия Pa/Pi [6]. Предикцию параметров острой токсичности синтезированных структур производили посредством программного продукта GUSAR (General Unrestricted Structure-Activity Relationships) [7].

Экспериментальные исследования in vivo были выполнены с использованием в эксперименте нелинейных половозрелых белых мышей обоих полов массой 18-24г (n=60) с учетом этических норм, изложенных в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1989) и одобрены комиссией по биоэтике ФГБОУ ВО ПГФА Минздрава России (протокол № 5 от 15.01.2024 г.).

Оценку острой токсичности при пероральном введении осуществляли методом фиксированной дозы (Fixed Dose Procedure, FDP), согласно протокола OECD №420 (ГОСТ 32296-2013 «Методы испытаний по воздействию химической продукции на организм человека. Основные требования к проведению испытаний по оценке острой токсичности при внутрижелудочном поступлении методом фиксированной дозы»). Класс токсичности определяли согласно GHS-классификации (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, GHS) [8]. Помимо определения летальных доз исследуемых веществ, также оценивали показатели острой интоксикации (поведенческие реакции, нервно-мышечную возбудимость, рефлексы, вегетативные эффекты). Общая продолжительность наблюдения составила 2 недели.

Исследование влияния изучаемых соединений на показатели мышечной силы животных оценивали в тесте подтягивания на горизонтальной перекладине («перекладина»). В ходе эксперимента фиксировали способность мышей подтянуться из положения виса на передних конечностях и зацепиться нижней конечностью за перекладину в течение 20 с, при этом отмечали количество лапок, участвующих в удержании животного, и производили оценку в баллах (1 лапа – 1 балл). Тест считался не выполненным (отрицательным), если животному требовалось больше времени или оно вовсе не удерживалось на перекладине [9].

Оценку влияния полученных веществ на мышечный тонус и координацию животных проводили с помощью теста «вращающийся стержень» [10], который представляет собой специальный аппарат «Ротарод» (ООО «Нейроботикс», Россия) со стержнем диаметром 3 см, вращающийся с переменным ускорением (от 4 до 40 об/мин). Регистрировали способность животных удерживаться на вращающемся со скоростью 8 об/мин стержне в течение 4-х минут и латентный период первого падения [9, 10]. Для достижения достоверных результатов эксперимента регистрацию показателей (латентный период до падения животного со стержня, скорость вращения стержня, скорость падения животного, а также общее пройденное расстояние и количество оборотов) осуществляли три раза в течение 5 минут с 10 минутным интервалом между подходами и предварительным трехкратным обучением мышей за час до введения веществ. Способность мышей сохранять равновесие и увеличивать время нахождения на вращающимся стержне рассматривали как положительное влияние на моторные функции и координацию животного.

Исследуемые соединения вводили перорально с помощью внутрижелудочного зонда в форме мелкодисперсной суспензии, стабилизированной твином-80, за 60 минут до начала эксперимента в скрининговой дозе 50 мг/кг. Животным контрольной группы был введен эквивалентный объем 0,9% раствора хлорида натрия.

Для статистической обработки экспериментальных данных применяли специализированное программное обеспечение (Statistica 6.0 и расширенный пакет анализа Microsoft Excel 2018). Были рассчитаны средние значения, стандартные отклонения (M ± m) и стандартные ошибки. Нормальность распределения данных оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка, при ненормальном распределении - U-критерий Манна-Уитни. Статистическую значимость различий между средними значениями определяли с помощью t-критерия Стьюдента, при этом уровень значимости устанавливали на уровне p < 0,05.

Полученные результаты и их обсуждение. Для 5-ти новых соединений (PV-150, PV-210, PV-220, PV-310, PV-410) при помощи программы PASS Online был выполнен прогноз фармакологических эффектов со стороны нервно-мышечной системы. Для всех исследуемых соединений были установлены значения вероятности проявления активности (Pa) в диапазоне от 0,210 до 0,355 (табл. 1).

Таблица 1 – Результаты прогноза изучаемых соединений
с помощью программы PASS Online

Шифр	Pa	Pi	Прогнозируемый эффект
PV-150	0,242	0,157	Лечение симптомов болезни Паркинсона
	0,291	0,220	Лечение дискинезий
	0,263	0,193	Спазмолитический
PV-210	0,309	0,130	Лечение миопатий
	0,218	0,121	Периферическая миорелаксация
	0,274	0,254	Лечение острых неврологических заболеваний
PV-220	0,355	0,107	Спазмолитический
	0,229	0,066	Активатор холинацетилтрансферазы
	0,210	0,176	Лечение мышечных дистрофий
PV-310	0,266	0,117	Лечение миопатий
	0,245	0,124	Периферическая миорелаксация
PV-410	0,214	0,120	Противопаркинсонический, устранение ригидности
	0,248	0,218	Лечение миопатий
	0,232	0,221	Лечение мышечных дистрофий

Данные значения свидетельствуют о достаточно высокой вероятности наличия влияния на нервно-мышечную систему, что обосновывает целесообразность экспериментальной оценки данных соединений.

 Прогноз GUSAR показал, что исследуемые соединения предварительно относятся к 4 классу опасности (вещества малотоксичные) по классификации GHS [8], что согласовывалось с экспериментальными данными, полученными в исследованиях острой токсичности in vivo (табл. 2). Введение веществ в фиксированной дозе 2000 мг/кг не вызывало гибели экспериментальных животных, их внешний вид и состояние отмечались как удовлетворительные.

Важно отметить, что проведенный анализ спектра фармакологических и токсических эффектов in silico представляет собой исключительно количественный прогноз вероятности проявления тех или иных биологических свойств исследуемых соединений, что позволяет оптимизировать временные и ресурсные затраты. Однако компьютерное прогнозирование не может служить полной заменой исследований in vivo.

Таблица 2 – Показатели острой токсичности изучаемых соединений, полученные методами in silico и in vivo

Соединение	LD50 in silico, мг/кг	LD50 in vivo, мг/кг	Класс опасности GHS
PV-150	2066	>2000	IV
PV-210	3037	>2000	IV
PV-220	2327	>2000	IV
PV-310	2024	>2000	IV
PV-410	3003	>2000	IV

 

Результаты теста «вращающийся стержень» показали, что у 4-х соединений PV-150, PV-220, PV-310 латентный период падения составлял более 3-х минут, превосходя показатели контрольной группы животных, что свидетельствует о положительном влиянии на мышечный тонус и отсутствии двигательно-координационных нарушений. У гетариламида PV-210 показатели латентного периода падения были сопоставимы с данными контрольной группы и не достигали 2-х минут, что свидетельствует об отсутствии значимого положительного влияния на координацию движения животных.

При этом при введении всех изучаемых соединений у животных не отмечалось нарушений мышечного тонуса и миорелаксации, что выражалось в способности подтянуться на «перекладине» (табл. 3).

Таблица 3 – Влияние изучаемых соединений на двигательную координацию и мышечный тонус (M±m)

Соединение	«Ротарод»	«Перекладина»
	ЛП падения, с	Удержание на проволоке, баллы
PV-150	160,52±44,84	3,50±0,37
PV-210	77,41±28,25	3,17±0,34
PV-220	194,57±46,38*	3,67±0,23
PV-310	190,15±39,83*	4,00±0,0
PV-410	190,34±28,58*	3,17±0,34
Контроль	94,70±20,59	4,00±0,0

Примечание: * = p <0,05 - по сравнению с интактным контролем

Выводы. Изучаемые гетариламиды 4-(гет)арил-2-гидрокси-4-оксобут-2-еновых кислот с фрагментами пиримидина (PV-150, PV-210, PV-220 PV-310, PV-410) относятся к малотоксичным веществам согласно классификации GHS. Выявлено отсутствие значимого влияния на мышечный тонус и улучшение координации движений у лабораторных животных для 4-х соединений, в большей степени прогноз in silico реализован у гетариламида PV-410.

About the authors

Anastasia Ivanovna Krasnova

Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education of the Ministry of Health of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: krasnova_ai@mail.ru

PhD, Associate Professor of the Department of Pharmacology

Russian Federation, 614990, Russia, Perm, Polevaya Street, 2.

Natalya Alekseevna Pulina

Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: nata@mail.ru

Doctor of Pharmacy, Professor, Head of the Department of Pharmaceutical Technology

Russian Federation, 614990, Russia, Perm, Polevaya Street, 2.

Valeria Dmitrievna Polezhaeva

Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: polezgaevalera@inbox.ru

Assistant of the Department of Pharmaceutical Technology

Russian Federation, 614990, Russia, Perm, Polevaya Street, 2.

References