POSSIBILITIES OF MODELING ENDOTHELIAL-MESENCHYMAL TRANSITION IN PRIMARY ENDOTHELIAL CELL CULTURES IN VITRO


Cite item

Full Text

Abstract

The aim of the study was to evaluate the prospects/likelihood/feasibility of in vitro endothelial-mesenchymal transition (endothelial-mesenchymal transition, EndMT) studies in primary human umbilical vein endothelial cell cultures (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) using specific concentrations and time of TGFβ1 expression.

Material and methods. The study was conducted on primary human umbilical vein endothelial cell culture HUVEC passage 3. Primary HUVEC cultures were cultured in ECGM culture medium for 3 days until a monolayer was formed, after which the nutrient medium was changed to serum-free DMEM F-12 medium for 3 hours. Then, HUVEC culture cells were incubated with recombinant human TGF-β1 (10 ng/ml) at 37°C for 72 hours. At the end of TGF-β1 exposure, the relative amounts of proteins characteristic of EndMT are obtained in cell lysates using Western blotting techniques: endothelial markers - cell adhesion molecules and platelets to endothelial cells-1 PECAM-1 (CD31) and von Willebrand factor (von Willebrand factor, vWF), as well as mesenic markers - fibronectin (fibronectin, FN), vimentin. (vimentin, VIM).

Results. The study found that exposure of the liver to TGF-β1 at a dose of 10 ng / ml for 3 days on the primary culture of HUVEC led to a significant decrease in the amount of CD31 by 45.4% and vWF by 34.3% compared to the control, confirmed by the services for confirming the loss of characteristic endothelial cell markers (r < 0.05). Exposure of primary HUVEC culture to TGF-β1 for 72 h significantly increased the relative amount of FN by 43.3% and VIM by 50.7% relative to the control (p<0.05), indicating the formation of endothelial cells with mesenchymal characteristics.

Conclusions. Exposure of primary HUVEC culture to human recombinant TGF-β1 in patients at 10 ng/ml for 3 days allows for reliable induction of EndMT in vitro, which is a statistically significant decrease in the relative amount of endothelial markers EndMT CD31 and vWF and a relative increase in the amount of mesenchymal markers FN and VIM in cultured cell lysates.

Full Text

Актуальность. Эндотелиально-мезенхимальный переход (Endothelial-mesenchymal transition, EndMT) был впервые описан в эндокардиальных подушках сердца эмбриона Markwald et al. [1]. EndMT приводит к молекулярным и структурным перестройкам, которые вызывают изменения в клетках, необходимые для перехода к мезенхимальному фенотипу. Эндотелиально-мезенхимальный переход – динамический процесс, в котором эндотелиальные клетки подавляют эндотелиальные свойства и приобретают характеристики мезенхимальных клеток. На начальных стадиях эндотелиоциты ослабляют свои межклеточные соединения, разрушают базальную мембрану и мигрируют в периваскулярную среду [2]. Отличительными особенностями EndMT являются утрата эндотелиоцитами специфических микровезикул, содержащих фактор фон Виллебранда (von Willebrand factor, vWF) [3]. Также происходит подавление молекул адгезии, таких как сосудистый кадгерин (vascular endothelial cadherin, VE-cadherin  (CD144) [4], молекула клеточной адгезии тромбоцитов к эндотелиальным клеткам-1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule 1, PECAM-1 (CD31) [5]. Ослабление адгезионных свойств приводит к повышению клеточной миграции, вследствие чего происходит увеличение MMP (матриксных металлопротеиназ), и повышение миофибробластических маркеров, таких как α-гладкомышечный актин (аlpha-smooth muscle actin, α-SMA) [6], виментин (vimentin, VIM) [7] и фибронектин (fibronectin, FN) [8]. Следовательно, EndMT приводит к снижению эндотелиальных свойств, таких как цитокин-индуцированная адгезия лейкоцитов и образование сосудов, а также к увеличению мезенхимальных свойств, например, отложение коллагена и сократительная способность.

EndMT является важным регулятором физиологических и патологических процессов в организме человека. Индукция EndMT может быть вызвана напряжением сдвига в сосудах, факторами воспаления, опухолевым ростом и многими другими причинами. Ключевым индуктором EndMT является трансформирующий фактор роста бета – transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) [9].

При анализе литературы стало понятно, что описанные методики предлагают широкий диапазон условий: различные сроки экспозиции, преинкубации и концентрации индуктора [10, 11, 12]. Опираясь на существующие протоколы, мы разработали оригинальный протокол комбинации параметров для моделирования TGF-β1-индуцированного EndMT в лаборатории клеточных технологий ЦНИЛ. Отличительной особенностью стало уменьшение времени инкубации культуры эндотелиоцитов в среде для преинкубации до 3-х часов, так как при более длительных сроках жизнеспособность клеток снижалась, а также использование строго определенных концентрации (10нг/мл) и времени экспозиции (3-е суток) человеческим рекомбинантным TGF-β1.

Основным регулятором EndMT является передача сигналов TGF-β. Все изоформы TGF-β 1, 2 и 3 могут индуцировать EndMT. Однако точная роль каждой изоформы может различаться [13]. Важность передачи сигналов TGF-β в индукции EndMT была продемонстрирована в нескольких исследованиях in vivo.

Трансформирующий фактор роста (TGF)-β – многофункциональный цитокин, экспрессируемый практически всеми видами тканей и клеток. TGF-β сигналинг регулирует множество клеточных реакций в процессах эмбриогенеза, заживления ран, тканевого и иммунного гомеостаза. Дисфункция TGF-β вносит значительный вклад в патогенез различных заболеваний.

В сердечно-сосудистой системе трансдукция TGF-β повышена при фиброзе миокарда, клапанов сердца и атеросклероза. Это обусловлено деятельностью стромальных мышечных клеток (smooth muscle cells, SMC), фибробластов, эндотелиоцитов и воспалительных клеток, таких как макрофаги [14]. TGF-β играет двойственную роль и может как стимулировать фибробласты к дифференцировке в миофибробласты, производить компоненты внутриклеточного матрикса (ВКМ) и ремоделировать сосудистую стенку, так и индуцировать EndMT в эндотелиальных клетках, вызывая фибробластический фенотип [15, 16]. Повсеместная экспрессия TGF-β в организме убедительно указывает на его критическую и множественную роль в физиологических процессах.

Цель нашего исследования оценить перспективу in vitro моделирования эндотелиально-мезенхимального перехода в первичных эндотелиоцитах HUVEC с использованием определенных концентрации и времени экспозиции TGFβ1.

Материал и методы исследования. Выделение первичных культур HUVEC.

Исследование было выполнено на первичной культуре эндотелиальных клеток вены пуповины человека HUVEC, выделенных из сегментов пуповин здоровых женщин-доноров, подписавших добровольное информированное согласие. Научная работа была одобрена локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России (протокол №2, от 16.09.2022). Полученный биологический материал доставляли в лабораторию клеточных технологий РязГМУ, где выделяли первичную культуру эндотелиальных клеток по протоколу Crampton (2007) [17]. Вену пуповины промывали физиологическим раствором от кровяных сгустков, в просвет сосуда вводили раствор 0,1% коллагеназы (кат. № GC305013-1g, «Servicebio», Китай), края сосуда зажимали и инкубировали при температуре 37℃ в течение 15 минут. После инкубации вену промывали теплым фосфатно-солевым буферным раствором DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline, кат. № Р061Е, «ПанЭко», Россия) над пробиркой, затем центрифугировали, а клеточный осадок высаживали на предварительно желатинизированный культуральный пластик (кат. № 70025', «SPL Lifesciences», Китай) [18].

Затем первичные культуры эндотелиальных клеток вены пуповины человека (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) культивировали в ростовой среде для эндотелиоцитов ECGM (Endothelial Cell Growth Medium, кат. № 211-500, «Целл апликацион). Далее моделировали EndMT путем добавления рекомбинантного человеческого TGF-β1.

Моделирование EndMT в первичной культуре эндотелиоцитов HUVEC.

Первичные культуры HUVEC засеивали в 6-луночные планшеты (кат. № 30006', «SPL Lifesciences», Китай) в количестве 3х105 клеток на лунку и культивировали в течение 3 суток до образования монослоя. Затем выполняли смену питательной среды на бессывороточную среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко с добавлением питательных веществ (F-12) (DMEM F-12) (кат. № С470Е, «ПанЭко», Россия) в течение 3-х часов. Далее клетки инкубировали с рекомбинантным человеческим TGF-β1 (10 нг/мл) при 37°C в течение 72 часов.

Подтверждение индукции EndMT в первичной культуре эндотелиоцитов HUVEC

По истечении времени инкубации с TGF-β1 (10 нг/мл), клетки открепляли от пластика раствором трипсин (0,25% трипсина с солями Хенкса, «ПанЭко», Россия) и промывали фосфатно-солевым раствором DPBS из расчета 1 × 106. Далее готовили клеточные лизаты в буфере RIPA (кат. № G2002-30ML, «Servicebio», Китай) для определения относительного количества маркеров EndMT методом Вестерн блот. Для измерения концентрации белка в лизате клеток использовали метод Бредфорда [19]. Для измерения концентрации белка в лизате клеток использовали метод Бредфорда [19]. 20 мкг белков клеточного лизата смешивали с буфером Laemli (BioRad, США), содержащим 2-меркаптоэтанол, в соотношении 1:2, далее фракционировали с помощью 10% полиакриламидных гелей SDS и переносили на нитроцеллюлозную мембрану, проводили блокировку (Servicebio, Китай). После инкубации с первичными антителами при 4 ° C в течение ночи мембраны затем инкубировали со вторичными антителами в течение 60 мин. Блоты визуализировали и анализировали с использованием системы ChemiDocXRS+ («Вио-Рад») и нормализовали по GAPDH.

Далее в лизатах клеток определяли относительное количество белков, характеризующих EndMT: эндотелиальных маркеров EndMT c использованием первичных кроличьих моноклональных антител CD31 (кат. № AF6191, «Affinity Biosciences», Китай) и von Willebrand factor, vWF (кат. № AF3000, «Affinity Biosciences», Китай); мезенхимальных маркеров - c использованием первичных кроличьих моноклональных антител Fibronectin (кат. № AF5335, «Affinity Biosciences», Китай) и Vimentin (кат. № AF0292, «Affinity Biosciences», Китай), GAPDH (кат. № AF5161, «Affinity Biosciences», Китай). Первичные антитела визуализировали при помощи вторичных козлиных антител (Goat anti-Rabbit IgG (H+L) кат. № S0013, «Affinity Biosciences», Китай). Количество маркеров EndMT определяли относительно содержания белка домашнего хозяйства GAPDH.

Статистическая обработка результатов. Полученные результаты анализировали при помощи программы ГрафПад Призм 8. Полученные результаты оценивали тестом ANOVA.

Для оценки статистической значимости различий в сравнении с контролем применяли тест Даннета. Статистически значимыми считались различия при p<0,05. Описанные выше эксперименты были повторены трижды.

Полученные результаты и их обсуждение. В ходе исследования было выявлено, что воздействие TGF-β1 (10 нг/мл) в течение 3 суток на клеточную культуру HUVEC достоверно снижало относительное количество CD31 на 45,4% и vWF на 34,3% относительно контроля, что говорит о потере эндотелиальными клетками своих характерных маркеров (р<0,05), что представлено на рис. 1.

Рис.1. Относительное количество маркеров эндотелиального профиля CD 31 и vWF
в клеточной культуре HUVEC при воздействии TGF-β1 в концентрации 10 нг/мл
в течение 72 ч (М ±SD, n = 3); А) – Влияние TGF-β1 на клеточную культуру HUVEC в течение 72 ч вызывало достоверное снижение относительного количества CD 31 на 45,4% относительно контроля; Б) – Влияние TGF-β1 на клеточную культуру HUVEC в течение 72 ч вызывало достоверное снижение относительного количества vWF на 34,3% относительно контроля; примеч. ** – р <0,005; *** – р =0,0005

 

Одновременно, воздействие TGF-β1 на первичную культуру HUVEC в течение 72 ч достоверно повышало относительное количество Fibronectin на 43,3% и Vimentin на 50,7% относительно контроля (р<0,05), что свидетельствует о приобретении эндотелиальными клетками мезенхимальных характеристик, что представлено на рис. 2.

Рис.2. Относительное количество маркеров мезенхимального профиля в клеточной культуре HUVEC при воздействии TGF-β1 в концентрации 10 нг/мл в течение 72 ч (М ±SD, n = 3) А – Fibronectin; Б – Vimentin; А) – Влияние TGF-β1 на клеточную культуру HUVEC в течение 72 ч вызывало достоверное повышение относительного количества Fibronectin на 43,3% относительно контроля; Б) – Влияние TGF-β1 на клеточную культуру HUVEC в течение 72 ч вызывало достоверное повышение относительного количества Vimentin на 50.7% относительно контроля; примеч. ** – р <0,005; *** –р =0,0001

 

Полученные данные сопоставимы с результатами других методик моделирования EndMT. Wang Z. et al. моделировали EndMT следующим образом: клетки HUVEC подвергали сывороточному голоданию в течение ночи, а затем обрабатывали 0, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 нг/мл TGF-β1 в течение 48 часов или обрабатывали 5 нг/мл TGF-β1 в течение 0, 1, 6, 12, 24, 48 и 72 часов. В результатах сообщалось, что TGF-β1 повышал экспрессию белка и мРНК α-SMA и коллагена I и подавлял экспрессию белков и мРНК VE-кадгерина и CD31, этот эффект достигал пика через 72 часа [12].

EndMT является важным участником эмбрионального развития, однако, в постнатальном периоде вносит весомый вклад в развитие патологий сердечно-сосудистой системы. Поэтому изучение данного процесса вызывает высокий научный интерес и обусловливает поиск экспериментальных моделей для его исследования. Моделирование EndMT in vitro является перспективной способом для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе развития этого явления, что позволяет избежать этических сложностей связанных с проведением экспериментов на животных, а также высоких экономических трат на масштабные клинические исследования.

Выводы. Воздействие человеческого рекомбинантного TGF-β1 в концентрации 10 нг/мл в течение 3 суток на первичную культуру HUVEC позволяет достоверно индуцировать EndMT in vitro, что подтверждается статистически значимым снижением относительного количества эндотелиальных маркеров EndMT CD31 и vWF и повышением относительного количества мезенхимальных маркеров Fibronectin и Vimentin в лизатах культур клеток.

×

About the authors

Екатерина Andreyevna Strelnikova

Ryazan State Medical University named after Academician I.P. Pavlov of the Russian Ministry of Health

Author for correspondence.
Email: ekaterina3333@rambler.ru

Junior Research Fellow at the Central Research Laboratory

Russian Federation, 90026, Russia, Ryazan, Vysokovoltnaya Street, 9

Roman Evgenievich Kalinin

Ryazan State Medical University named after Academician I.P. Pavlov of the Russian Ministry of Health

Email: glms.rokptd@mail.ru

MD, Professor, Head of the Department of Cardiovascular, X-ray Endovascular Surgery, and Radiation Diagnostics

Russian Federation, 90026, Russia, Ryazan, Vysokovoltnaya Street, 9

Igor Александрович Suchkov

Ryazan State Medical University named after Academician I.P. Pavlov of the Russian Ministry of Health

Email: i.suchkov@rzgmu.ru

MD, Professor of the Department of Cardiovascular, X-ray Endovascular Surgery, and Radiation Diagnostics

Russian Federation, 90026, Russia, Ryazan, Vysokovoltnaya Street, 9

Julia Vladimirovna Abalenikhina

Ryazan State Medical University named after Academician I.P. Pavlov of the Russian Ministry of Health

Email: Abalenihina88@mail.ru

Doctor of Medical Sciences, Associate Professor, Professor of the Department of Biological Chemistry

Russian Federation, 90026, Russia, Ryazan, Vysokovoltnaya Street, 9

Nina Jansugovna Mzhavanadze

Ryazan State Medical University named after Academician I.P. Pavlov of the Russian Ministry of Health

Email: nina_mzhavanade@mail.ru

Doctor of Medical Sciences, Associate Professor, Professor of the Department of Cardiovascular, X-Ray Endovascular Surgery and Radiation Diagnostics, Chief Researcher at the Central Research Institute

Russian Federation, 90026, Russia, Ryazan, Vysokovoltnaya Street, 9

References

  1. Markwald R. R., Fitzharris T. P., Manasek F. J. Structural development of endocardial cushions //American Journal of Anatomy. – 1977. – Т. 148. – №. 1. – С. 85-119.
  2. Alvandi Z., Bischoff J. Endothelial-mesenchymal transition in cardiovascular disease //Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. – 2021. – Т. 41. – №. 9. – С. 2357-2369.
  3. Калинин Р. Е. и др. Фактор фон виллебранда при выполнении инвазивных вмешательств у больных с периферическим атеросклерозом //Российский медико-биологический вестник имени академика ИП Павлова. – 2021. – Т. 29. – №. 3. – С. 389-396.
  4. Nan W. et al. Molecular mechanism of VE-cadherin in regulating endothelial cell behaviour during angiogenesis //Frontiers in physiology. – 2023. – Т. 14. – С. 1234104.
  5. Wu Q. et al. PECAM-1 drives β-catenin-mediated EndMT via internalization in colon cancer with diabetes mellitus //Cell Communication and Signaling. – 2023. – Т. 21. – №. 1. – С. 203.
  6. Ding H. et al. TGF-β-induced α-SMA expression is mediated by C/EBPβ acetylation in human alveolar epithelial cells //Molecular medicine. – 2021. – Т. 27. – С. 1-12.
  7. Ridge K. M. et al. Roles of vimentin in health and disease //Genes & development. – 2022. – Т. 36. – №. 7-8. – С. 391-407.
  8. Patten J., Wang K. Fibronectin in development and wound healing //Advanced drug delivery reviews. – 2021. – Т. 170. – С. 353-368.
  9. Piera-Velazquez S., Jimenez S. A. Endothelial to mesenchymal transition: role in physiology and in the pathogenesis of human diseases //Physiological reviews. – 2019. – Т. 99. – №. 2. – С. 1281-1324.
  10. Ma J. et al. TGF-β-induced endothelial to mesenchymal transition is determined by a balance between SNAIL and ID factors //Frontiers in Cell and Developmental Biology. – 2021. – Т. 9. – С. 616610.
  11. Ursoli Ferreira F. et al. Endothelial cells tissue-specific origins affects their responsiveness to TGF-β2 during endothelial-to-mesenchymal transition //International journal of molecular sciences. – 2019. – Т. 20. – №. 3. – С. 458.
  12. Wang Z. et al. Role of endothelial‐to‐mesenchymal transition induced by TGF‐β1 in transplant kidney interstitial fibrosis //Journal of cellular and molecular medicine. 2017. – Т.21, №. 10. – С. 2359-2369.
  13. Tzavlaki K., Moustakas A. TGF-β Signaling //Biomolecules. – 2020. – Т. 10. – №. 3. – С. 487.
  14. Alvandi Z., Bischoff J. Endothelial-mesenchymal transition in cardiovascular disease //Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. – 2021. – Т. 41. – №. 9. – С. 2357-2369.
  15. Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M. & Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Res 67, 10123–10128.
  16. Frangogiannis N. G. Transforming growth factor-β in myocardial disease //Nature Reviews Cardiology. – 2022. – Т. 19. – №. 7. – С. 435-455..
  17. Crampton S.P., Davis J., Hughes C.C. // J Vis Exp. 2007. Vol. 3. P.183.
  18. Мжаванадзе Н. Д. и др. Эндотелий in vivo и in vitro. Часть 2: особенности и перспективы лабораторной работы с эндотелиоцитами //Наука молодых–Eruditio Juvenium. – 2020. – Т. 8. – №. 3. – С. 407-421.
  19. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding //Analytical biochemistry. – 1976. – Т. 72. – №. 1-2. – С. 248-254.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies