Ryazan State Medical University

Maria I'm sorry, I'm sorry. Konopleva; Коноплева Мария Григорьевна; Natalya Vasilevna Korotkova; Короткова Наталья Васильевна; Roman Evgenievich Kalinin; Калинин Роман Евгеньевич; Igor Aleksandrovich Suchkov; Сучков Игорь Александрович; Alexander Alexeyevich Nikiforov; Никифоров Александр Алексеевич; Larisa Vladimirovna Nikiforova; Никифорова Лариса Владимировна

doi:10.18499/2070-9277-2025-28-1-69-75

Ryazan State Medical University

Authors: Konopleva M.I.¹, Korotkova N.V.¹, Kalinin R.E.¹, Suchkov I.A.¹, Nikiforov A.A.¹, Nikiforova L.V.¹
Affiliations:
1. I.P. Pavlov Ryazan State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation
Issue: Vol 28, No 1 (2025): Опубликован 28.03.2025
Pages: 69-75
Section: Биохимия
URL: https://new.vestnik-surgery.com/index.php/2070-9277/article/view/10749
DOI: https://doi.org/10.18499/2070-9277-2025-28-1-69-75

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Statistics

Abstract

The aim of this work was to evaluate the relationship between the concentration of TGF-β1 and the activity of cathepsins in vascular wall homogenates in patients with varicose veins of the lower extremities at different stages of the disease according to the CEAP classification. The concentration of TGF-β1 in the vascular wall homogenate was determined by sandwich ELISA on a StatFax 2100 enzyme immunoassay analyzer (microplatereader) (Awareness technology Inc. Palm City, FL 34990, USA). The results were expressed in pg/ml. The activity of cathepsins B, L and H in the vascular wall homogenate was determined using the Barrett and Kirschke spectrofluorimetric method on a Shimadzu RF 6000 spectrofluorimeter (Shimadzu Corporation, Japan). The results were expressed in nmol/hr×g of protein. Our study revealed changes in the concentration levels of TGF-β1 and the activity of captesins B, L, and H, which may indicate a violation of their regulation and be a central pathogenetic link in the remodeling of varicose veins of the lower extremities.

Keywords

transforming growth factor-β1, cathepsins B, L, H, varicose veins of the lower extremities, extracellular matrix

Full Text

Актуальность. Варикозное расширение вен — это форма сердечно-сосудистой патологии, характеризующаяся хроническим рецидивированием [1, 2]. Согласно статистике, данное заболевание встречается у 35% женщин и 25% мужчин [3].

Многочисленные теории и предположения свидетельствуют о глубоких молекулярных, гистологических и биохимических преобразованиях, происходящих в клетках и внеклеточном матриксе сосудистых стенок при развитии варикозной болезни вен [4].

По одной из теорий, повреждение стенок и клапанов вен может быть вызвано асептическими воспалительными реакциями и венозной гипертензией [5].

Также было предположено, что повышение давления в венах может стимулировать активацию эндотелия и производство факторов роста, таких как: TGF-β-трансформирующий фактор роста-β и VEGF-фактор роста эндотелия сосудов, которые способствуют росту сосудов. Это также может привести к повышенной экспрессии молекул адгезии VCAM-1 (от англ. vascular cell adhesion molecule-1) и ICAM-1 (от англ. intercellular adhesion molecule-1), а также сигнальных молекул, которые приводят к активации и миграции лейкоцитов [6].

Ремоделирование сосудистой стенки варикозно расширенных вен контролируется множеством факторов, в том числе трансформирующим фактором роста-β1 и сопровождается изменением процессов протеолиза [7].

Материал и методы исследования. Исследование одобрено на заседании локального этического комитета ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России (протокол
№ 3 от 15.09.2023).

Основная группа включала 25 пациентов с подтвержденным диагнозом варикозное расширение вен нижних конечностей, проходивших лечение в ГБУ РО «БСМП» и в ГБУ РО «ОКБ» в 2023-2024 г. Контрольная группа включала 25 практически здоровых диц - доноров, сопоставимых с основной группой по возрасту и полу. Средний возраст составил 54,4±5. Критерии включения: подписанное информированное согласие, подтвержденный диагноз варикозное расширение вен нижних конечностей, отсутствие пороков развития венозной системы. Критерии исключения: обструктивные поражения глубоких вен, посттромботический синдром с вторично измененными поверхностными венами, патология со стороны дыхательной системы.

Материал исследования - гомогенат сосудистой стенки пораженных варикозом вен. У пациентов основной группы забор биологического материала производился во время проведения флебэктомии по поводу варикозного расширения вен. У доноров контрольной группы участки здоровых вен были взяты в процессе бедренно-подколенного шунтирования с использованием аутовены. Полученные сосуды очищали от частиц жировой ткани и остатков крови, проводили взвешивание на электронных весах. Затем измельчали образец ткани и гомогенизировали с добавлением лизис-буфера в стакане гомогенизатора «Potter S» (Сарториус) для определения концентрации TGF-β1 и с добавлением холодного раствора 0,25 М сахарозы для определения активности катепсинов. Центрифугировали гомогенат 15 минут 3000 оборотов/минуту на центрифуге, полученный супернатант использовали в качестве материала для исследования.

Определение концентрации TGF-β1 в гомогенате сосудистой стенки проводили сэндвич-методом ИФА на иммуноферментном анализаторе StatFax 2100 (microplatereader). Результаты выражались в пг/мл.

Определение активнoсти катепсинов В, L и Н в гомогенате сосудистой стенки проводили спектрофлуориметрическим методом по Barrett и Kirschke на спектрофлуориметре Shimadzu RF 6000 (Шимаду корпорацион). Результаты выражались в нмоль/ч×г белка.

Полученные результаты прошли обработку методами непараметрической статистики с использованием пакетов прикладных статистических программ. Различия между показателями считались статистически значимыми при р≤0,05 для всех проведенных исследований.

Полученные результаты и их обсуждение. Концентрацию TGF-β1 в гомогенатах стенки сосудов у пациентов с ВРВНК сравнивали в зависимости от стадии заболевания по классификации CEAР (Рисунок 1). Концентрация TGF-β1 была статистически значимо повышена при стадии C2s по сравнению с контролем (p=0,05); при стадии C3s уровень TGF-β1 значительно повышался по сравнению с контролем (p=0,0002). Уровень TGF-β1 был самым высоким в этой группе, с двукратным увеличением по сравнению с контрольной группой. Концентрация TGF-β1 при стадии C4s также имела однонаправленную тенденцию и увеличивалась по сравнению с контролем (p=0,04). На стадии C5s-C6s показатели концентрации TGF-β1 были на 5% выше, чем в контрольной группе, однако эта разница не была статистически значимой (p=0,5). Полученные результаты, возможно, ассоциируются с гистологическими и морфологическими изменениями, которые характерны для последних стадий заболевания. Происходят атрофические изменения венозной стенки, нарушение эластического компонента с накоплением большого количества кислых гликозаминогликанов в субэндотелиальном слое, истончение мышечной оболочки с увеличением количества коллагеновых волокон. Для этих стадий так же свойственно наличие трофических язв: пятая стадия сопровождается появлением закрытых язв, шестая - открытых язв [8].

Рис. 1. Концентрация TGF-β1 в гомогенате варикозно расширенных вен в зависимости от стадии заболевания по классификации СЕАР, пг/мл

Примечание: * - статистически значимое отличие концентрации TGF-β1 у пациентов с ВРВНК от группы контроля, р≤0,05

Следующим этапом нашего исследования явилась оценка активности катепсинов B, L и H в гомогенате сосудистой стенки у пациентов с варикозным расширением вен нижних конечностей в зависимости от стадии заболевания по классификации СЕАР.

Активность катепсина В, в гомогенате варикозно расширенных вен со стадией заболевания С2s по классификации СЕАР, демонстрировала статистически значимое повышение по сравнению с контрольной группой (Рисунок 2).

Рис. 2. Активность катепсина В в гомогенате варикозно расширенных вен в зависимости от стадии заболевания по классификации СЕАР, пг/мл

Примечание. Статистически значимое повышение: * - активности катепсина B у пациентов с ВРВНК С2s от группы контроля, р≤0,05; ** – активности катепсина B у пациентов с ВРВНК С2s от стадий С3s, C4s, C5s-C6s по классификации СЕАР, р≤0,05

В то время как при стадиях заболевания С3s, C4s, C5s-C6s активность катепсина В статистически значимых отличий не имеет от группы контроля. Межгрупповые отличия отмечаются между стадией С2s и остальными стадиями по классификации СЕАР и имеет однонаправленное снижение.

Тенденция повышения активности катепсина L по сравнению с контрольной группой отмечается в гомогенате варикозно расширенных вен со стадией заболевания С2s по классификации СЕАР, при этом стадии С3s, C4s, C5s-C6s имеют однонаправленную тенденцию к снижению по сравнению с группой контроля (Рисунок 3).

Рис. 3. Активность катепсина L в гомогенате варикозно расширенных вен в зависимости от стадии заболевания по классификации СЕАР, пг/мл

Примечание. Статистически значимое повышение: * - активности катепсина L у пациентов с ВРВНК С2s от группы контроля, р≤0,05; ** –активности катепсина L у пациентов с ВРВНК С2s от стадий С3s, C4s, C5s-C6s по классификации СЕАР, р≤0,05

При статистическом анализе катепсина H его активность в гомогенате варикозно расширенных вен, со стадиями заболевания С2s, С5s-C6s по классификации СЕАР, демонстрировали значимое повышение по сравнению с контрольной группой, при стадиях С3s, C4s снижение относительно контроля (Рисунок 4).

Рис. 4. Активность катепсина H в гомогенате варикозно расширенных вен в зависимости от стадии заболевания по классификации СЕАР, пг/мл

Примечание. Статистически значимое повышение * -активности катепсина Н у пациентов с ВРВНК С2s от группы контроля, р≤0,05; ** активности катепсина Н у пациентов с ВРВНК С2s от стадий С3s, C4s, C5s-C6s по классификации СЕАР, р≤0,05

Полученные данные можно обосновать тем, что именно на стадии заболевания С2 происходит варикозная трансформация подкожных вен согласно МКБ-10. В данном исследовании были выявлены корреляционные связи средней степени между показателями TGF-β1 и лизосомальными катепсинами (R=0,38). Имеются исследования показывающие, что трансформирующий фактор роста-β1 подавляет активность катепсинов [9]. Также в литературных данных встречаются доказательства подтверждающие, что цистеиновые катепсины, в том числе катепсин B, влияет на TGF-β1-управляемый путь Smad и участвуют в миофиброгенезе [10]. Ингибирование катепсина В снижает фосфорилирование Smad 2/3, но при этом не влияет на фосфорилирование MAPK, это указывает на то, что катепсин В нарушает TGF-β1-SMAD-сигнальный каскад [11].

TGF-β1 принимает участие в деформации стенки вены, через активацию миофибробластов и избыточную продукцию внеклеточного матрикса, вызывая фиброз [12, 13]. В настоящее время, согласно некоторым литературным данным, сигнальный каскад, посредством которого TGF-β1 воздействует на фибробласты, включает две части: внеклеточно регулируемую митоген-активируемую протеинкиназу (MAPK) и TGF-β1-SMAD-сигнальный каскад [14]. TGF-β1 находится в неактивном состоянии (латентная форма) и выделяется в секретируемой форме. Внеклеточная активация белка необходима для связывания с соответствующим рецептором и происходит под действием протеаз, что приводит к разрушению латентного комплекса. Активный TGF-β выполняет свою биологическую функцию, связываясь с тремя типами рецепторов (TGF-βRI, TGF-βRII и TGF-βRIII). Рецепторы представляют собой серин-треониновые киназы, которые активируют различные клеточные сигнальные пути, такие как SMAD и MAPK [15].

Повышенная активность катепсинов обеспечивает протеолитический механизм венозного ремоделирования. По данным научной литературы, оно связано с активацией ИЛ-1 и фактора некроза опухоли-альфа, которые регулируют экспрессию катепсинов в варикозных венах. Усиленный протеолиз, связанный с воспалением, подтверждается повышенной активностью триптазы и химазы, а также большим количеством тучных клеток и CD3+Т-клеток, которые являются важными источниками катепсинов. Следовательно, активация катепсинов и их ингибиторов может способствовать процессу венозного ремоделирования за счет эффективной деградации матрикса. Большое количество цистеинил-катепсинов обнаружено в Т-клетках при варикозном расширении вен. Катепсины обладают эластолитической и коллагенолитической активностью, что приводит к ремоделированию внеклеточного матрикса венозной стенки, инфильтрации воспалительными клетками, к перестройке и миграции гладкомышечных клеток. Активация катепсинов и их ингибиторов может способствовать процессу ремоделирования вен за счёт эффективной деградации матрикса [16].

Выводы. Согласно вышеперечисленным данным, установлено статистически значимое повышение уровня TGF-β1 в гомогенатах сосудистой стенки у пациентов с варикозным расширением вен нижних конечностей по сравнению с контрольной группой. Максимальное значение концентрации TGF-β1 наблюдается у пациентов со стадией С3s. Также получено статистически значимое повышение активности катепсинов B, L, H при стадии заболевания С2s и снижение активности по сравнению с контролем на других стадиях заболевания по классификации СЕАР. Выявлены корреляционные связи средней степени между показателями TGF-β1 и лизосомальными катепсинами (R=0,38).