Participation of the farnesoid X receptor in the regulation of the OATP1B1 transporter protein when exposed to S-nitrosoglutathione in vitro

Full Text

Актуальность. Транспорт эндогенных и экзогенных веществ через билипидные мембраны может осуществляться не только пассивной диффузией, но и с помощью специфических белков-транспортеров, которые классифицируются на АТФ-связывающие транспортные белки и транспортеры, растворенных веществ (Solute carrier family, SLC) [1, 2]. Полипептид, транспортирующий органические анионы (OATP1B1) относится к семейству SLC. В настоящее время доказано, что OATP1B1 локализуется главным образом в гепатоцитах и  принимает участие в инфлюксе эндогенных соединений (желчные кислоты, тиреоидные гормоны, билирубин, коръюгированные стероиды), а также ксенобиотиков (статины, антибактериальные средства, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, противогрипковые и противоопухолевые средства, т.д.) [3].  

ОАТР1В1 человека кодируется геном SLCO1В1. Ведущими факторами, регулирующими транскрипцию SLCO1B1,  являются печёночный Х рецептор α (liver X receptor, LXR α), фарнезоидный Х рецептор (рецептор желчных кислот, farnesoid X receptor, FXR) и ретиноидный Х рецептор (retinoid X receptor, RXR) [4]. 

FXR способен напрямую связываться с промотором генов SLCO и регулировать его транскрипцию, а также может реализовывать свой механизм опосредованно через желчные кислоты, которые подавляют экспрессию OATP1B1 [5].  

Таким образом, FXR может как повышать, так и снижать количество OATP1B1 в клетках печени, вследствие чего выступает в качестве регуляторной мишени. 

S-нитрозоглутатион является S-нитрозированным производным глутатиона и рассматривается в донора оксида азота II (NO). В свою очередь, NO важный внутриклеточный мессенджер, который участвует в регуляции эффлюксного белка-транспортера P-гликопротеина как через NO-сигнальный каскад, так и рецепторы конститутивный андростановый рецептор (CAR) и прегнан Х рецептор (PXR) [6]. 

Таким образом, в настоящее время хорошо описаны индукторы и ингибиторы OATP1B1, но отсутствует информация о воздействии доноров оксида азота (II) и механизмах регуляции данного белка. 

Цель – изучить влияние донора NO  S-нитрозоглутатиона на OATP1B1 и роль FXR в данном процессе. 

Материал и методы исследования.  Исследование выполнено на культуре клеток HepG2 (ФГБУН ИНЦ РАН, Санкт-Петербург). Клетки культивировали при 37°С и 5% содержании СО2 в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л), содержащей L-глутамин (4 мМ), 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (все компоненты производства Сигма-Альдрих). 

В качестве контроля в эксперименте использовали клетки, которые инкубировали в питательной среде без добавления тестируемых веществ.  
S-нитрозоглутатион вносили в питательную среду в концентрациях 1, 10, 50 и 100 мкМ, срок инкубации составил 72 ч, смену среды проводили каждые сутки. 

Для оценки роли FXR в регуляции функционирования белка-транспортера OATP1B1 в эксперименте использовали ингибитор рецептора тауро-β-холевую кислоту (β-TХК) в концентрации 200 мкМ (Сигма-Альдрих) [7]. Инкубацию клеток проводили в комбинации S-нитрозоглутатиона и β-TХК в концентрации 200 мкМ (за 30 мин до внесения в питательную среду тестируемого вещества) в течение 72 часов.  

Протокол исследования был одобрен Биоэтической комиссией РязГМУ Минздрава России (Протокол № 87 от 07.11.2023). 

Для выполнения биохимических анализов клетки культивировали в 6-луночных планшетах («Корнинг», n=3 на каждую концентрацию тестируемого вещества). 

Жизнеспособность клеток после воздействия S-нитрозоглутатиона оценивали по степени активности митохондрий. В работе использовали клеточно-проникающие зонды Мито Тракер Ред CM-H2 XRos («Инвитроген»), которые окрашивают активные митохондрии в живых клетках, флуоресцентный анализ проводили при  λext = 579 нм, λem = 599 нм [8]. 

Уровень оксида азота (II) определяли с помощью реагента DAF-FM («Инвитроген»), флуоресцентный анализ проводили при λext = 495 нм, λem = 515 нм [9]. 

Количественную оценку уровня живых митохондрий и оксида азота определяли по степени флуоресценции с помощью спектрофлуориметра («Шимадру РФ-6000») и пересчитывали на количество клеток (счетчик и анализатор жизнеспособности клеток «Коунтесс 3 Автомат счетчик клеток»), полученные данные выражали в ед.фл./106 клеток.  

Относительное количество ОАТР1В1 оценивали методом вестерн-блот. Перед приготовлением клеточного лизата клетки снимали с лунок 6-луночного планшета раствором трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, Сигма Альдрих), затем промывали раствором фосфатного буфера 3 раза (БиоРед).  Лизис клеток проводили с помощью буфера NP40 Клеточный буфер для лизиса Термо (Терми Фишер Синтетик), срок инкубации 30 минут, температура +4 °C, 100 мкл буфера на 107 клеток. Далее приготовленный лизат центрифугировали при 5000 g (СМ-50, Эпперндорф), полученный супернатант использовали для выполнения анализа. 

Электрофорез и последующий анализ вестерн-блоттинга проводили согласно стандартному протоколу [6]. Для работы использовались первичные мышиные моноклональные антитела (OATP2 поликлональное антитело, PA5-113548, Инвитроген), для визуализации которых  с применялись вторичные кроличьи антитела (кролячьи-мышиные  IgG (H+L) Вторичные Антитела, HRP, Инвитроген).   

С целью подтверждения молекулярной массы ОАТР1В1 использовали маркер молекулярной массы Точность плюс стандарты белка Двойной цвет, Био-Ред). Для регистрации хемилюминисценции использовали ХемиДокXRS+ («Био-Ред»), интенсивность полученных бендов анализировали с использованием программного обеспечения ИмиджЛаб (ХемиДок). Для стандартизации и расчета относительного количества ОАТР1В1 оценивали относительное количество глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH, англ.: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, первичные антитела GAPDH Загрузка контрольного моноклонального антитела (GA1R), ДуЛигт 68 («Инвитрожен»), вторичные кроличьи антитела (IgG (H+L) Вторичное антитело, HRP, Инвитрожен). 

Результаты анализировали с помощью патетов стандартных статистических программ. Статистическую значимость различий оценивали дисперсионным анализом (ANOVA), парные сравнения с контролем выполняли с помощью теста Даннетта. Результаты на графиках приведены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения (M ± SD). Статистически значимыми считали различия при р<0,05. 

Полученные результаты и их обсуждение.  Выбранные концентрации  
S-нитрозоглутатиона были протестированы на активность митохондрий, что характеризует жизнеспособность клеток. Мито Такер Ред CM-H2XRos является восстановленным, нефлуоресцентным зондом на основе розамина, которые флуоресцируют при окислении. Флуоресцентные зонды пассивно проникают через плазматическую мембрану и накапливаются в активных митохондриях. После того, как митохондрии помечены выполнялся количественный анализ. В ходе работы было получено, что в диапазоне концентраций 1-50 мкМ S-нитрозоглутатион не оказывал действия на митохондрии клеток линии HepG2, а концентрация 100 мкМ приводила к снижению их активности – флуоресценция нижалась на 28,6%  (р=0,001) (рис. 1).   

 

 

Рис. 1. Влияние S-нитрозоглутатиона в концентрациях 1, 10, 50 и 100 мкМ и сроке воздействия 72 ч на активность митохондрий клеток  линии HepG2 

Примечание: ***р<0,001 относительно значений контрольной группы 

 

DAF-FM - это реагент, который используется для обнаружения и количественного определения низких концентраций оксида азота (II). Реактив не флуоресцирует, пока не вступит в реакцию с NO с образованием флуоресцирующего бензотриазола. 

Уровень оксида азота (II) дозозависимо возрастал при воздействии  
S-нитрозоглутатиона в концентрациях 1,10,50 и 100 мкМ на 82,8% (р=0,02), 212,9% (р<0,0001), 297,6% (р<0,0001), 427,4% (р<0,0001) соответственно (рис. 2) по сравнению с показателями контроля, что подтверждает адекватность выбранной экспериментальной модели. 

 

Рис. 2. Влияние S-нитрозоглутатиона в концентрациях 1, 10, 50 и 100 мкМ и сроке воздействия 72 ч на содержание оксида азота (II) в клетках линии HepG2. 

Примечание: *р<0,05, **** р<0,0001 относительно значений контрольной группы 

Воздействие S-нитрозоглутатиона в концентрациях 10, 50 и 100 мкМ в течение 72 ч приводило к увеличению относительного количества ОАТР1В1 на 37,6% (р=0,032), 45,8% (р=0,004), 137,4% (р<0,0001) соответственно (рис. 3). S-нитрозоглутатион в концентрации 1 мкМ не оказывал воздействия на уровень белка-транспортера.  

Далее проводили оценку самостоятельного влияния β-TХК на относительное количество ОАТР1В1 без воздействия тестируемого вещества S-нитрозоглутатиона. В ходе работы было получено, что относительное количество ОАТР1В1 не изменялось при воздействии β-TХК, а, следовательно, ингибитор FXR не оказывает самостоятельное действие на белок-транспортер и может использоваться для дальнейшей работы (рис. 3). 

При внесении в питательную среду β-TХК за 30 мин до воздействия  
S-нитрозоглутатиона относительное количество ОАТР1В1 не изменялось по сравнению с контрольными значениями. Таким образом ингибитор β-TХК препятствовал индукции OATP1B1, вызванной донором оксида азота (II) -  
S-нитрозоглутатионом, а следовательно FXR принимает участие в биохимическом каскаде регуляции повышения количества белка-транспортера ОАТР1В1 при воздействии  S-нитрозоглутатиона. 

 

Рис.3. Влияние S-нитрозоглутатиона на относительное количество белка-транспортера OATP1B1 в клетках линии HepG2 самостоятельно и в сочетании с ингибированием фарнезоидного рецептора (тауро-β-холевой кислотой, 200 мкМ). 

 Примечание: 1 - контроль (без добавления тестируемых веществ);  
2,3,4, 5 –  S-нитрозоглутатион в концентрациях 1,10, 50 100 мкМ соответственно; 
6 - β-таурохолевая кислота, 200 мкМ; 7, 8, 9 – S-нитрозоглутатион в концентрациях  
10, 50 100 мкМ в сочетании с тауро- β-холевой кислотой,  
200 мкМ.** р < 0,01, ****р< 0,0001  относительно значений контрольной группы 

 

OATP1B1 представляет собой инфлюксный белок-транспортер, участвующий в переносе биологически активных молекул и лекарственных веществ внутрь гепатоцитов. В настоящее время известно несколько механизмов регуляции OATP1B1: прямое ингибирование, транскрипционная, пост-транскрипционная и пост-трансляционная регуляция [4].  

Фарнезоидный X рецептор является ядерным рецептором, который участвует в сохранении целостности и функций печени при хронических и острых поражениях. Известно, что FXR модулирует экспрессию белков-транспортеров и ферментов, тем самым действуя на стыке метаболизма липидов, лекарственных средств и влияя на начало и прогрессирование гепатотоксичности различных этиопатогенезов [10]. 

В настоящем исследовании доказано, что при воздействии S-нитрозоглутатиона в концентрациях 10, 50 и 100 мкМ происходит увеличение относительного количества OATP1B1. Данные изменения происходят на фоне повышения уровня оксида азота (II), что указывает на вклад NO в механизмы регуляции OATP1B1.  

Применение ингибитора фарнезоидного Х рецептора - тауро-β-холевой кислоты на фоне воздействия S-нитрозоглутатиона приводило к подавлению индуцирующего эффекта донора оксида азота. Таким образом, полученные результаты указывают на то, что S-нитрозоглутатион (10, 50, 100 мкМ) способствует увеличению относительного количества  OATP1B1 посредством фарнезоидного Х рецептора.  

Выводы. S-нитрозоглутатион в концентрациях 10, 50, 100 мкМ и сроке инкубации 72 ч повышает относительное количество OATP1B1, действуя через фарнезоидный Х рецептор. 

About the authors

Olga Nikolaevna Suchkova

Federal State Budgetary Educational Institution of the Ryazan State Medical University of the Ministry of Health of Russia

Author for correspondence.
Email: suchkovaon2102@mail.ru

Assistant of the Department of Biological Chemistry

Russian Federation, 9 Vysokovoltnaya str., Ryazan, 390026, Russia.

Julia Vladimirovna Abalenikhina

Federal State Budgetary Educational Institution of the Ryazan State Medical University of the Ministry of Health of Russia

Email: abalenihina88@mail.ru

MD, Associate Professor, Professor of the Department of Biological Chemistry

Russian Federation, 9 Vysokovoltnaya str., Ryazan, 390026, Russia.

Alexey Vladimirovich Shchulkin

Federal State Budgetary Educational Institution of the Ryazan State Medical University of the Ministry of Health of Russia

Email: alekseyshulkin@rambler.ru

MD, Associate Professor, Professor of the Department of Pharmacology

Russian Federation, 9 Vysokovoltnaya str., Ryazan, 390026, Russia.

Fidan Tofikovna Gadzhieva

Federal State Budgetary Educational Institution of the Ryazan State Medical University of the Ministry of Health of Russia

Email: fidagadzhiieva2003@gmail.com

student

Russian Federation, 9 Vysokovoltnaya str., Ryazan, 390026, Russia.

Marat Galievich Uzbeks

Federal State University Moscow Scientific Research Institute of Psychiatry

Email: uzbekovmg@gmail.com

MD, Professor, Head of the Laboratory of Brain Biochemistry

Russian Federation, 119334, Russia, Moscow, 5th Donskoy passage, 21a, p. 11.

Elena Nikolaevna Yakusheva

Federal State Budgetary Educational Institution of the Ryazan State Medical University of the Ministry of Health of Russia

Email: e.yakusheva@rzgmu.ru

Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department of Pharmacology

Russian Federation, 9 Vysokovoltnaya str., Ryazan, 390026, Russia.

References