The role of the P-glycoprotein transporter protein in the penetration of rotenone into the brain through the blood-brain barrier

Maria Mikhailovna Granidar; Градинарь Мария Михайловна; Alexey Vladimirovich Shchulkin; Щулькин Алексей Владимирович; Pavel Yurievich Mylnikov; Мыльников Павел Юрьевич; Ivan Vladimirovich Black; Черных Иван Владимирович; Elena Nikolaevna Yakusheva; Якушева Елена Николаевна

doi:10.18499/2070-9277-2024-27-2-86-93

The role of the P-glycoprotein transporter protein in the penetration of rotenone into the brain through the blood-brain barrier

Authors: Granidar M.M.¹, Shchulkin A.V.¹, Mylnikov P.Y.¹, Black I.V.¹, Yakusheva E.N.¹
Affiliations:
1. Academician I.P. Pavlov Ryazan State Medical University
Issue: Vol 27, No 2 (2024): Опубликован 28.06.2024
Pages: 86-93
Section: Фармацевтическая химия, фармакогнозия
URL: https://new.vestnik-surgery.com/index.php/2070-9277/article/view/10113
DOI: https://doi.org/10.18499/2070-9277-2024-27-2-86-93

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Statistics

Abstract

The purpose of the study was to investigate the role of the transporter protein P-glycoprotein in the penetration of rotenone into the brain through the blood-brain barrier, as well as the prospect of its induction to reduce the severity of symptoms of parkinsonism caused by the neurotoxin. Materials and methods. Three groups of Wistar rats were used in the experiments. In the first group, the penetration of rotenone into the brain was assessed after its intravenous administration at a dose of 0.2 mg/kg. The amount of rotenone in the brain was detected by HPLC-UV. In the second group, the level of Pgp in the midbrain, striatum and cerebral cortex of rats was studied using ELISA. In the third group, the severity of parkinsonian syndrome was studied during a course of rotenone administration. Each group included 2 series of animals: control and experimental. Control group of animals was injected with the water for injection intragastrically. In order to induce P-glycoprotein, experimental animals were intragastrically administered rifampicin at a dose of 20 mg/kg. Results. A single intravenous administration of rotenone at a dose of 0.2 mg/kg to rats was accompanied by penetration of the test substance into the brain through the blood-brain barrier, and the induction of Pgp by rifampicin reduced it. Administration of rifampicin led to the increase in the amount of Pgp in the striatum, midbrain and cerebral cortex of rats. The severity of parkinsonism symptoms was significantly lower in experimental group treated with rifampicin compared to the control group. Conclusion. In the course of this study, it was established that the Pgp transporter protein takes part in limiting the penetration of rotenone into the brain of Wistar rats through the blood-brain barrier, and its induction can have a protective effect, reducing the severity of the manifestations of cerebral toxic effects of the studied substance.

Keywords

Rotenone, parkinsonism, P-glycoprotein, neurotoxin, blood-brain barrier.

Full Text

Актуальность. Согласно имеющимся исследованиям, распространённость паркинсонизма составляет 120-180 случаев на 100000 населения. Данный показатель продолжает неуклонно расти [1]. Паркинсонизм  это двигательный синдром, который проявляется ригидностью, тремором и брадикинезией. Причиной паркинсонизма является болезнь Паркинсона и вторичные формы паркинсонизма (сосудистый, лекарственный, токсический, постравматический, опухоли, гидроцефалия, постэнценцефалический) [2]. В возникновении токсического паркинсонизма одну из ведущих ролей играют пестициды. В недавнем мета-анализе 46 исследований было показано, что пестициды увеличивают относительный риск развития паркинсонизма в 1,6 раз (95% доверительный интервал 1,40, 1,88) [3]. Одним из таких пестицидов является ротенон. Это митохондриальный яд, который ингибирует I комплекс цепи переноса электронов [4]. В экспериментальных моделях ротенон вызывает избирательное повреждение дофаминергических нейронов в черной субстанции и накопление патологического белка альфа-синуклеина, что является ключевым патологическим признаком болезни Паркинсона [5]. Поскольку ротенон является растительным веществом, он считался органическим пестицидом и длительное время широко использовался в качестве бытового инсектицида в домашнем садоводстве и сельском хозяйстве, а также для искоренения инвазивных видов рыб. Показано, что у людей, которые когда-либо использовали ротенон риск возникновения болезни Паркинсона увеличивается в 2,5 раза [6].

Гликопротеин-Р (Pgp) – трансмембранный белок-транспортер, кодируемый геном MDR1, который осуществляет эффлюкс широкого ряда лекарственных веществ и ксенобиотиков за счет энергии АТФ [7]. Данный белок в гематоэнцефалическом барьере ограничивает проникновение различных ксенобиотиков и/ или их метаболитов в центральную нервную систему [8]. Показана принадлежность нейротоксинов, в том числе и ротенона, вызывающих паркинсонизм, к субстратам Pgp [9].

Целью исследования явилось изучить роль белка-транспортера Pgp в проникновении ротенона в головной мозг через гематоэнцефалический барьер и перспективу его индукции для снижения выраженности симптомов паркинсонизма вызванного нейротоксином.

Материал и методы исследования. Работа выполнена на крысах-самцах wistar массой 280–320 г. Исследование было одобрено биоэтической комиссией (протокол №11 от 29.01.2018 г).

Все животные были разделены на 3 группы.

Первая группа – оценка проникновения ротенона в головной мозг животных после его внутривенного введения в дозе 0,2 мг/кг, включала две серии:

а) Контроль – крысы, которым внутрижелудочно вводили воду для инъекций в течение 14 дней (n=15);

б) Индукция Pgp – крысы, которым внутрижелудочно вводили рифампицин в дозе 20 мг/кг два раза в день в течение 14 дней (n=15);

После введения исследуемых веществ, крысам внутривенно вводили ротенон в дозе 0,2 мг/кг. Через 5, 15 и 30 мин по 5 животных выводились из эксперимента. Для анализа забиралась кора больших полушарий головного мозга.

Пробоподготовка осуществлялась следующим образом: ткань мозга массой 500 мг гомогенизировали при 24 000 об/мин в 500 мкл деионизированной воды в течение 1 мин на гомогенизаторе DIAX 900. Осаждение белков осуществляли ацетонитрилом (2,5 мл) путём встряхивания на приборе Shaker при 500 оборотах в мин в течение 10 мин, после чего центрифугировали при 1750 g в течение 10 мин и отбирали надосадочную жидкость.

Органический слой упаривали на роторно-вакуумном испарителе (Heidolph instruments, Германия). Сухой остаток растворяли в 250 мкл подвижной фазы и 100 мкл раствора вводили в хроматограф.

Количественное определение ротенона в гомогенате коры больших полушарий головного мозга крыс осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием (ВЭЖХ-УФ) при длине волны 296 нм на хроматографе «Стайер» (Россия). Применяли обращенно-фазную хроматографическую колонку Luna C18 100Å (250*4,6) с зернением 5 мкм. Ввод проб в петлю хроматографа осуществляли шприцом «Microsyringes» (Германия).

Условия хроматографирования. Температура разделения – 37°С. Скорость потока – 1 мл/мин. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила и воды в объёмном отношении 30:70. Время удерживания ротенона в данных условиях составило 6,72 мин. Аналитический диапазон методики составил 62,5 – 1000,0 нг/мл [11].

Вторая группа экспериментов, посвящённая изучению уровня Pgp в среднем мозге, стриатуме и коре больших полушарий головного мозга крыс, включала две серии:

а) Контроль – крысы, которым внутрижелудочно вводили воду для инъекций в течение 14 дней (n=5);

б) Индукция Pgp – крысы, которым внутрижелудочно вводили рифампицин в дозе 20 мг/кг два раза в день в течение 14 дней (n=5);

После введения исследуемых веществ, животных выводили из эксперимента, для анализа забирались образцы среднего мозге, стриатума и коры больших полушарий головного мозга крыс.

Полученные образцы гомогенизировали на гомогенизаторе DIAX 900 при 26000 об/мин в фосфатном буфере (pH 7,2) на холоде в соотношении 1:1 в течение 1 мин, затем подвергали трехкратному замораживанию–размораживанию при –20°С для разрушения цитоплазматических мембран, а затем центрифугировали при 1500 g 15 мин. Анализировали надосадочный слой методом иммуноферментного анализа (ELISA kit, BlueGene, Китай). Количество транспортера рассчитывали в пересчете на общую массу белка, которую определяли по методу Брэдфорда (Themofisher kit, США).

Третья группа экспериментов – изучение выраженности паркинсонического синдрома при курсовом введении ротенона, включала две серии:

а) Норма – крысы, которым внутрижелудочно вводили воду в течение 7 дней (n=5), а затем в течение 28 сут подкожно вводили стерильное подсолнечное масло (растворитель ротенона);

б) Введение рифампицина – животные, которым внутрижелудочно вводили рифампицин в дозе 20 мг/кг два раза в день в течение 7 дней (n=5), а затем в течение 28 сут комбинацию рифампицина внутрижелудочно и подсолнечного масла подкожно;

в) Контроль – крысы, которым внутрижелудочно вводили воду в течение 7 дней (n=5), а затем в течение 28 сут продолжали вводить воду и подкожно вводили ротенон в дозе 2,5 мг/кг;

г) Индукция Pgp и введение ротенона – крысы, которым внутрижелудочно вводили рифампицин в дозе 20 мг/кг два раза в день в течение 7 дней (n=5), а затем в течение 28 сут комбинацию рифампицина внутрижелудочно и ротенона подкожно. В конце исследования у животных оценивали выраженность паркинсонизма – наличие гипо-, бради- и олигокинезии, постуральной нестабильности, неустойчивой походки, ригидности мышц, тремора покоя, нарушения равновесия) по трехбальной шкале, где 1 балл соответствовал низкой степени выраженности признака, 2 балла – средней степени, 3 балла – высокой степени, после чего рассчитывали суммарную выраженность признаков паркинсонизма [10].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета програм. Характер распределения данных определяли по критерию Шапиро–Уилка. При нормальном распределении данных статистическую значимость различий оценивали с помощью теста ANOVA, попарные сравнения выполняли с помощью критерия Тьюки. При распределении данных, отличном от нормального, различия между сериями оценивали с помощью критерия Крускала–Уоллиса. При уровне значимости менее 0,05 проводили парное сравнение параметров с помощью критерия Манна–Уитни с поправкой Бонферонни. Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартное отклонение при нормальном распределении данных или медианы, нижнего и верхнего квартилей при распределении данных, отличном от нормального.

Полученные результаты и их обсуждение. Однократное внутривенное введение ротенона в дозе 0,2 мг/кг крысам wistar сопровождалось проникновением тестируемого вещества в головной мозг через гематоэнцефалический барьер. Концентрация ротенона в коре больших полушарий головного мозга крыс достигала максимальной концентрации на 5 мин после внутривенного введения, а затем постепенно снижалась, достигая минимальных значений на 30 мин (табл. 1).

Таблица 1 – Влияние курсового введения рифампицина на концентрацию ротенона
в коре больших полушарий головного мозга крыс (нг/г ткани, M±SD)

Серия эксперимента	Время после внутривенного введения ротенона
Серия эксперимента	5 мин (n=5)	15 мин (n=5)	30 мин (n=5)
Контроль	325,0±44,6	134,3±36,9	79,9±8,2
Рифампицин 14 дней	173,5±14,9*	122,8±25,6	74,0±26,6

Примечание: * p<0,001 – достоверные различия по сравнению с показателями контроля.

Для оценки роли белка-транспортера Pgp в защите головного мозга от воздействия ротенона вызывали его индукцию курсовым внутрижелудочным введением рифампицина в дозе 20 мг/кг в течение 14 дней и повторно оценивали проникновение ротенона в головной мозг крыс.

Рифампицин повышает экспрессию Pgp, действуя через транскрипционный фактор прегнан Х рецептор (PXR) [12].

Для подтверждения индукции Pgp оценивали количество транспортера в среднем мозге, стриатуме и коре больших полушарий и головного мозга крыс. В ходе исследования было показано, что введение рифампицина в течение 14 дней вызывает повышение количества Pgp в стриатуме в 6,1 раза (p=0,004), в среднем мозге в 3,3 раза (p=0,004), в коре больших полушарий в 2,79 раза (p=0,004) (табл. 2). Полученные данные подтверждают индукцию изучаемого белка-транспортера.

Таблица 2 – Влияние рифампицина на количество Pgp в головном мозге животных

Серия эксперимента	Уровень Pgp в стриатуме	Уровень Pgp в среднем мозге	Уровень Pgp в коре больших полушарий
Контроль (n=5)	325,2 (261,01; 702,4)	331,7 (304,5; 382,1)	305,3 (289,35; 309,5)
Рифампицин 14 дней (n=5)	1995,8 (1532,9; 2107,3)*	1095,4 (943,7; 1245,61)*	853,79 (835,23; 950,57)*

Примечание: * - p<0,01 – достоверные различия по сравнению с показателями контроля

При введении ротенона, после предварительной индукции Pgp курсовым введением рифампицина, его концентрация в головном мозге крыс через 5 мин после введения снижалась на 46,6% (p<0,001) по сравнению с контролем, а в остальные сроки достоверно от него не отличались. При это концентрация ротенона также плавно снижалась от 5 мин к 30 мин.

Дополнительно в рамках исследования рассчитывали AUC0-t -площадь под кривой концентрация ротенона в мозге-время (рис. 1), которая показывает общее количество ротенона, проникшее в головной мозг через гематоэнцефаличсекий барьер [13]. В ходе исследования было показано, что AUC0-t ротенона у животных, которым предварительно водили рифампицин была на 28,1% (p=0,0055) ниже, чем у контрольных животных.

Рис. 1. Влияние курсового введения рифампицина на общее количество ротенона, проникшее в кору больших полушарий головного мозга крыс (M±SD)

Примечание: * p<0,01 – достоверные различия по сравнению с показателями контроля.

Таким образом, в совокупности полученные результаты свидетельствуют о том, что предварительная индукция Pgp в гематоэнцефалическом барьере коры больших полушарий головного мозга крыс приводит к снижению проникновения ротенона в головной мозг, после его внутривенного введения.

На заключительном этапе оценивалась возможность профилактики развития токсического паркинсонизма, вызванного введением ротенона, за счет предварительной индукции Pgp, с помощью курсового применения рифампицина.

Рифампицина вводили внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг в течение 7 суток, а затем в течение 28 дней – ротенон подкожно в дозе 2,5 мг/кг один раз в сутки совместно с внутрижелудочным введением рифампицина в дозе 20 мг/кг два раза в день.

Введение ротенона в течение 28 сут приводило к развитию типичных признаков паркинсонизма: снижалась двигательная активность, появлялись постуральная нестабильность, неустойчивость походки, ригидность мышц и тремор покоя, нарушалось равновесие. Суммарный балл выраженности признаков паркинсонизма составил 8 (6; 10) и достоверно превышал показатели контрольных животных (p<0,05) (табл. 3).

У экспериментальных животных данной серии уменьшалась выраженность признаков паркинсонизма по сравнению с крысами, получавшими только ротенон, суммарный балл выраженности признаков паркинсонизма снизился на 43,7% (p<0,05) (рис. 2).

Рис. 2. Признаки выраженности паркинсонизма на 28 сутки введения препарата

Примечания: 1 – масла подсолнечного, 2 – рифампицина, 3 - ротенона, 4 - рифампицина
в сочетании с ротеноном; достоверные различия при p<0,05 * с серией 1; # с серией 3.

Стратегия индукции Pgp с целью защиты от токсических веществ описана в некоторых исследованиях. Так, индукция Pgp производными тиоксантоновой кислоты, снижают токсичность, вызванной паракватом в клетках линии Caco-2 [14.] Лечение препаратами, которые индуцируют активность Pgp в ГЭБ, может быть многообещающим подходом к ослаблению симптомов Болезнь Альцгеймера, вызванных отложением β-амилоида в головном мозге, путем усиления выведения нейротоксичных Aβ-пептидов из головного мозга [15].