Identifiers of nitrosative stress in peripheral atherosclerosis
- Authors: Korotkova N.V.1, Kalinin N.E.1, Suchkov I.A.1, Мжаванадзе N.D.1, Nikiforov A.A.1
-
Affiliations:
- FGBOU IN Ryazan State Medical University
- Issue: Vol 27, No 2 (2024): Опубликован 28.06.2024
- Pages: 56-52
- Section: Биохимия
- URL: https://new.vestnik-surgery.com/index.php/2070-9277/article/view/10107
- DOI: https://doi.org/10.18499/2070-9277-2024-27-2-56-52
Cite item
Full Text
Abstract
Nitrosative stress is a component in the pathogenesis of many diseases, including the cardiovascular system. Toxic products formed as a result of the interaction of excessive amounts of nitric oxide (II) affect the structure of proteins, interacting with the functional groups of the latter, and disrupt the functioning of enzymes. As a result, nitrosative stress products are formed, which can be markers of the severity of the pathology. Peripheral atherosclerosis is a common pathology that leads to disability and mortality. The purpose of the presented study was to study markers of nitrosative stress in the blood serum of patients with peripheral atherosclerosis. Such indicators as the final metabolites of nitric oxide, nitrothyrosine, bityrosine, as well as the level of inducible and endothelial NO synthases were determined. An increase in the level of inducible NO synthase was revealed without changing the level of endothelial NO synthase, and a multidirectional change in the concentration of markers of nitrosative damage: an increase in the final metabolites of nitric oxide and nitrothyrosine, a decrease in the level of bityrosine crosslinking in the serum of patients with peripheral atherosclerosi
Full Text
Актуальность. Нитрозативный стресс – это изменение протекания биохимических и метаболических процессов в клетках вследствие увеличения генерации оксида азота (II) и продукции активных форм азота (АФА), оказывающих цитотоксический эффект.
Известно, что оксид азота (NO) является высоко реакционноспособной молекулой, которая была впервые описана Робертом Френсисом Ферчготтом и его коллегами, как сигнальная молекула сердечно-сосудистой системы, более 20 лет назад [1]. Для NO в настоящее время показано большое разнообразие биохимических функций: он модулирует сердечную деятельность, регулируя сосудистый тонус [2], участвует в возбуждении-сокращении кардиомиоцитов [3], агрегации тромбоцитов и в обеспечении митохондриальной функции [4].
NO синтезируется в результате превращения аминокислоты L-аргинина в L-цитруллин с участием трех изоформ синтазы оксида азота (NOS). Эндотелиальная NOS (eNOS) локализуется в кавеолах сарколеммы эндотелиоцитов, нейрональная (nNOS) - в саркоплазматическом ретикулуме [5]. Обе синтазы экспрессируются конститутивно; в отличие от них индуцибельная NOS (iNOS) экспрессируется в условиях стресса, обычно при провоспалительных состояниях. [6]. Существует мнение, что сам NO и его производные действуют, как жизненно важные сигнальные молекулы, и участвуют в кардиозащите путем активации растворимой гуанилатциклазы с целью последующего образования внутриклеточного вторичного мессенджера цГМФ, мишенью которого являются ионные каналы, ц-ГМФ-зависимые протеинкиназы и фосфодиэстераза ц-ГМФ. Ещё один путь заключается в модификации активности белков-мишеней путем непосредственного S-нитрозилирования белков, при котором фрагмент NO ковалентно присоединяется к свободной тиольной группе цистеина [7].
Одна из свободных форм кислорода – гидроксильный радикал, взаимодействует с NO, с образованием высоко токсичного производного - пероксинитрита (ONOO−), который, наряду с другими окислителями, производными NO, обозначаются как RNS (reactive nitrogen species, активные формы азота, АФА) [8]. В нефизиологических концентрациях пероксинитрит оказывает токсическое воздействие на клетки и способствует развитию эндотелиальной дисфункции, влияя на белки и ферменты, вызывая нитрозилирование аминокислотных остатков триптофана; окисление боковых цепей белков по остаткам цистеина, тирозина, метионина; окисление атомов металлов в молекулах металло- и гемпротеинов.
Атеросклероз сосудов нижних конечностей – важная проблема современной флебологии, вследствие которой возможна инвалидизация с последующим снижением уровня качества жизни, а также смертность населения. Периферический атеросклероз является симптомом системного атеросклероза, приводящего к частичной окклюзии крупных артерий, сосудистой недостаточности и ограничению артериального кровотока. Заболеваемость периферическим атеросклерозом растет во всех странах мира, в настоящее время затрагивая 5% населения в возрасте от 45 до 49 лет; до 18% в возрасте от 85 до 89 лет. Прогнозируется дальнейшее увеличение заболеваемости периферическим атеросклерозом примерно на 30-50% к 2045 году [9].
Возраст, предшествующие сосудистые заболевания, сахарный диабет, артериальная гипертензия и никотиновая зависимость являются важными предикторами атеросклероза. Необходимо отметить, что АФК и АФА также могут вносить свой вклад в повреждение эндотелиоцитов при атеросклерозе вследствие того, что для них присуще мембрано-токсическое действие; это способствует повреждению лизосомальных мембран и высвобождению лизосомальных ферментов, деградирующих биополимеры, в конечном итоге приводя к некрозу и апоптозу клеток [10, 11].
Целью настоящего исследования явилось изучение содержания продуктов метаболизма-идентификаторов нитрозативного стресса у пациентов с периферическим атеросклерозом: нитротирозина, битирозина, метаболитов оксида азота, а также уровня индуцибельной и эндотелиальной NO-синтаз.
Материал и методы исследования. Дизайн исследования утверждён на заседании ЛЭК РязГМУ (протокол № 9 от 15.04.2020). Объектом исследования явился 31 пациент с диагнозом атеросклероз артерий нижних конечностей. Контрольную группу составили 30 здоровых лиц. В качестве материала для исследования использовалась сыворотка крови. После однократного забора крови у пациентов и доноров, который осуществлялся утром после 12-часового голодания, кровь центрифугировали и хранили при температуре минус 20оС не более 2-х месяцев.
В работе использовались следующие методы исследования: количественное определение NO-синтаз проводили сэндвич-методом ИФА на иммуноферментном анализаторе Stat Fax 2100 (microplate reader; Awareness technology Inc., США). Результаты выражали в нг/мл. Количественное определение нитротирозина проводили с использованием конкурентного ИФА с последующей детекцией на иммуноферментном анализаторе Stat Fax 2100 (microplate reader; Awareness technology Inc., США). Результаты выражали в нг/мл.
Метаболиты оксида азота (нитраты и нитриты) определяли по методу В.А.Метельской [12]. Метод основан на восстановлении NO–3 до NO–2 хлоридом ванадия (III) с дальнейшей спектрофотометрической детекцией нитрата по полученному окрашиванию в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса. Интенсивность окраски определяли в видимой области спектра с регистрацией на микропланшетном анализаторе StatFax 2100 (microplate reader; Awareness Technology Inc., США) при длине волны 540 нм. Результаты выражали в мкмоль/л сыворотки крови.
Образование битирозина регистрировали по интенсивности флуоресценции в фосфатном буфере (рН 7,4) на спектрофлуориметре «Shimadzu RF-6000» (Япония) при длине волны возбуждения λext=325 нм и длине волны эмиссии λEm=415 нм. Полученные результаты выражали в единицах флуоресценции на мл сыворотки.
Результаты обрабатывали методами непараметрической статистики с использованием программ Microsoft Office Excel 2016 и IBM SPSS Statistics 26 (StatSoftInc., США). Нормальность распределения выборки оценивали по критерию Колмогорова-Смирнова. Для определения статистической значимости различий непрерывных величин использовали U-критерий Манна-Уитни, данные представляли в формате Me (Q1 – Q3), где Ме – медиана, Q1 - нижний квартиль, Q3 - верхний квартиль, минимальное и максимальное значения и межквартильный размах. Различия между показателями считались статистически значимыми при р ≤ 0,05.
Полученные результаты и их обсуждение. При проведении исследования мы получили следующие результаты. Из изучаемых показателей нитрозативного стресса статистически значимо повышалась концентрация метаболитов оксида азота (табл. 1).
В настоящее время известно, что метаболизм NO в организме осуществляется за счет внутреннего функционирования семейства NO-синтаз, и внешнего поступления нитрат- и нитрит-ионов с продуктами питания. При этом возможны взаимопревращения NO в нитрат и нитрит. Вследствие этого так называемые конечные продукты метаболизма NO (метаболиты (NO –2 +NO –3 = NOx), ранее считавшиеся инертными, в настоящее время рассматриваются, как и сам оксид азота, в качестве сигнальных молекул; во-первых, за счет потенциальной возможности модифицировать белковые молекулы путем N-и S-нитрозилирования, во-вторых, за счет способности восстанавливаться до биодоступной молекулы оксида азота (II).
Таблица 1 - Показатели нитрозативного стресса в сыворотке крови пациентов с периферическим атеросклерозом по сравнению с группой контроля
Группа | Медиана | Мин | Макс | Q1 | Q3 | Межквартильный размах |
Конечные метаболиты NO, мкмоль/л | ||||||
Контрольная группа | 43,15 | 9,97 | 127,1 | 33,5 | 51,12 | 17,62 |
Пациенты с периферическим атеросклерозом | 76,21* р=0,002 | 15,75 | 241,8 | 50,22 | 122,24 | 72,02 |
Нитротирозин, нг/мл | ||||||
Контрольная группа | 350,9 | 259,5 | 589,1 | 320,0 | 560,8 | 240,8 |
Пациенты с периферическим атеросклерозом | 556,3 | 192,8 | 597,8 | 364,9 | 580,9 | 216,0 |
Битирозин, ед.флюоресценции/мл | ||||||
Контрольная группа | 19,46 | 0,69 | 41,9 | 14,1 | 26,0 | 11,9 |
Пациенты с периферическим атеросклерозом | 13,75 | 2,5 | 115,73 | 4,6 | 67,87 | 63,27 |
Примечание: * – статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05)
Мы также отметили повышение уровня нитротирозина в сыворотке крови пациентов с атеросклерозом по сравнению с контролем на 58,7%. Есть мнение, что нитротирозин является маркером генерации АФА при ряде клинических состояний. Повышение его концентрации в сыворотке крови является результатом воздействия пероксинитрита, и является маркером ряда заболеваний, среди которых и заболевания сердечно-сосудистой системых [13]. Мнения ученых об уровне нитротирозина в плазме крови разнятся. Одни исследователи отмечают повышение нитротирозина у пациентов с различной патологией, другие детектируют снижение его уровня ниже значений контрольной группы, вследствие чего данный вопрос требует дальнейшего более глубокого изучения.
Большая часть нитротирозина превращается далее в битирозин (3,3-дитирозин), отмечено, что образование последнего превалирует над нитротирозином, особенно при длительном воздействии АФА, вследствие чего он также используется в качестве маркера нитрозативного стресса [14]. В нашем исследовании мы получили снижение концентрации битирозина в сыворотке крови пациентов с периферическим атеросклерозом по сравнению со здоровыми донорами на 29,3 %, но данное снижение не явилось статистически значимым.
Уровень NO-синтаз демонстрировал следующие результаты (табл. 2). Содержание индуцибельной NO-cинтазы статистически значимо повышалось в сыворотке крови пациентов с атеросклерозом по сравнению с группой контроля, тогда как содержание эндотелиальной NO-синтазы не отличалось у пациентов с атеросклерозом и участников контрольной группы.
Таблица 2 - Уровень NO-синтаз в сыворотке крови пациентов с периферическим атеросклерозом по сравнению с группой контроля, нг/мл
Группа | Медиана | Мин | Макс | Q1 | Q3 | Межквартильный размах |
iNOS, нг/мл | ||||||
Контрольная группа | 0,19 | 0,01 | 3,3 | 0,11 | 0,28 | 0,17 |
Пациенты с периферическим атеросклерозом | 0,41* р=0,016 | 0,02 | 16,28 | 0,12 | 5,03 | 4,91 |
eNOS, нг/мл | ||||||
Контрольная группа | 0,12 | 0,01 | 0,34 | 0,08 | 0,13 | 0,05 |
Пациенты с периферическим атеросклерозом | 0,16 | 0,02 | 0,23 | 0,10 | 0,17 | 0,07 |
Примечание: * – статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05)
В настоящее время в целом нет единого взгляда на роль iNО синтазы в патологии. По мнению ряда ученых, повышенная экспрессия указанного фермента является вредным фактором именно вследствие образования токсичного для клеток пероксинитрита. Так, A.M. Shah и соавторы указали, что ее повышенная активация способствуют выработке ONOO− и способствует развитию эндотелиальной дисфункции [15]. Mungrue и соавторы в исследовании, выполненном на модели кардиомиоцитов трансгенных мышей, предположили, что сверхэкспрессия iNOS вызывает кардиомиопатию, брадиаритмию и внезапную смерть от сердечной недостаточности [16]. В противовес этому утверждению другие учёные предполагают, что повышение активности iNOS при патологии имеет защитный механизм. Так, P. Zhang и соавторы в своём исследовании показали, что селективное ингибирование iNOS может быть эффективным для лечения сердечной дисфункции, связанной с систолической перегрузкой [17]. Существует мнение, что iNOS способствует регуляции артериального давления, противодействуя эффектам, вызванным сверхэкспрессией мощных вазоконстрикторов, к примеру, эндотелина-1.
Таким образом, можно предположить, что iNOS способствует развитию повреждающих эффектов заболевания при воспалительном процессе, и её ингибирование можно использовать в качестве терапевтического мероприятия в лечении сердечно-сосудистых заболеваний. В отсутствие активности eNOS iNOS может играть компенсаторную роль за счет поддержания выработки NO, обеспечивая защиту, например, миокарда от гиперсократительных реакций.
Кроме того, в научной литературе имеются сведения о влиянии iNOS на развитие атеросклероза. Так, Lind M. и соавторы в эксперименте на морских свинках, с целью оценки эффектов ингибирования iNOS при гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции, не отмечали признаков атеросклероза в грудном отделе аорты, и сделали вывод, что повышение iNOS оказывает протективное действие, по крайней мере, на ранних стадиях данного заболевания [18].
Выводы. В представленном исследовании показано, что у пациентов с периферическим атеросклерозом в сыворотке крови отмечается повышение уровня индуцибельной NO синтазы без изменения уровня эндотелиальной NO синтазы, наблюдается разнонаправленное изменение концентрации маркеров нитрозативного повреждения: увеличение метаболитов оксида азота и нитротирозина, снижение уровня битирозиновых сшивок. Таким образом, периферический атеросклероз ассоциирован с изменением показателей нитрозативного стресса, но механизмы участия оксида азота (II) в патогенезе данной патологии требуют дальнейшего более углубленного изучения
About the authors
Natalya Vasilevna Korotkova
FGBOU IN Ryazan State Medical University
Author for correspondence.
Email: fnv8@yandex.ru
PhD, Associate Professor, Associate Professor of the Department of Biological Chemistry
Russian Federation, 390026, Ryazan, Vysokovoltnaya str., d 9Novel Evgenievich Kalinin
FGBOU IN Ryazan State Medical University
Email: kalinin-re@yandex.ru
MD, Professor, Head of the Department of Cardiovascular, X-ray Endovascular Surgery and Radiology
Russian Federation, 390026, Ryazan, Vysokovoltnaya str., d 9Igor Aleksandrovich Suchkov
FGBOU IN Ryazan State Medical University
Email: suchkov_med@mail.ru
MD, Professor, Professor of the Department of Cardiovascular, X-ray Endovascular Surgery and Radiology
Russian Federation, 390026, Ryazan, Vysokovoltnaya str., d 9Nina Dzhansugovna Мжаванадзе
FGBOU IN Ryazan State Medical University
Email: nina_mzhavanadze@mail.ru
MD, Associate Professor, Professor of the Department of Cardiovascular, X-ray Endovascular Surgery and Radiology
Russian Federation, 390026, Ryazan, Vysokovoltnaya str., d 9Alexander Alexeyevich Nikiforov
FGBOU IN Ryazan State Medical University
Email: alnik003@yandex.ru
Head of the Central Research Institute
Russian Federation, 390026, Ryazan, Vysokovoltnaya str., d 9References
- Martin W. Robert F. Furchgott, Nobel laureate (1916-2009)–a personal reflection. Br. J. Pharmacol. 2009; 158:633–637. doi: 10.1111/j.1476-5381.2009.00418.x.
- Bryan N.S. Nitric oxide deficiency is a primary driver of hypertension. Biochem Pharmacol. 2022;206:115325. doi: 10.1016/j.bcp.2022.115325.
- Hammond J., Balligand J.L. Nitric oxide synthase and cyclic GMP signaling in cardiac myocytes: From contractility to remodeling. J. Mol. Cell Cardiol. 2012; 52:330–340. doi: 10.1016/j.yjmcc.2011.07.029.
- Wang Z., Yang N., Hou Y., Li Y., Yin C., Yang E. L-Arginine-Loaded Gold Nanocages Ameliorate Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury by Promoting Nitric Oxide Production and Maintaining Mitochondrial Function. Adv Sci (Weinh). 2023;10(26):e2302123. doi: 10.1002/advs.202302123
- Idigo W.O., Reilly S., Zhang M.H., Zhang Y.H., Jayaram R., Carnicer R. Regulation of endothelial nitric-oxide synthase (NOS) S-glutathionylation by neuronal NOS: Evidence of a functional interaction between myocardial constitutive NOS isoforms. J. Biol. Chem. 2012; 287: 43665–43673. doi: 10.1074/jbc.M112.412031.
- Cinelli M.A., Do H.T., Miley G.P., Silverman R.B. Inducible nitric oxide synthase: Regulation, structure, and inhibition. Med. Res. Rev. 2020; 40:158–189. doi: 10.1002/med.21599.
- Tegeder I. Nitric oxide mediated redox regulation of protein homeostasis. Cell Signal. 2019; 53:348–356. doi: 10.1016/j.cellsig.2018.10.019.
- Hou J., Yu K., Sunwoo K., Kim W., Koo S., Wang J. Fluorescent Imaging of Reactive Oxygen and Nitrogen Species Associated with Pathophysiological Processes. Chem. Res. Toxicol. 2020; 6:832–866. doi: 10.1016/j.chempr.2019.12.005.
- Nordanstig J., Behrendt C.A., Bradbury A.W., de Borst G.J., Fowkes Fgr , Golledge J. et al. Peripheral arterial disease (PAD) - A challenging manifestation of atherosclerosis. Prev Med. 2023;171:107489. doi: 10.1016/j.ypmed.2023.107489. doi: 10.1016/j.ypmed.2023.107489.
- Калинин Р.Е., Сучков И.А., Климентова Э.А., Щулькин А.В., Пшенников А.С., Мыльников П.Ю., Егоров А.А. Показатели митохондриального пути апоптоза в сыворотке крови и гомогенате сосудистой стенки у пациентов с атеросклерозом периферических артерий. Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2021;9(2):226-234. doi: 10.23888/HMJ202192226-234.
- Калинин Р.Е., Сучков И.А., Климентова Э.А., Егоров А.А., Карпов В.В. Биомаркеры апоптоза и пролиферации клеток в диагностике прогрессирования атеросклероза в различных сосудистых бассейнах. Российский медико-биологический вестник им. академика И.П. Павлова. 2022; (30)2:243-252. doi: 10.17816/PAVLOVJ88938
- Метельская В.А., Н.Г. Гуманова. Скрининг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови человека. Клиническая лабораторная диагностика. 2005; 6:15-18. ISSN: 0869-2084.
- Сорокина Е.Г., Радыгина Т.В., Реутов В.П., Бакаева З.В., Афанасьева С.А., Петричук С.В. и др. Окислительный стресс и модификация белков крови у детей с воспалительными заболеваниями кишечника. Российский педиатрический журнал. 2023;26(4):252-257. doi: 10.46563/1560-9561-2023-26-4-252-257.
- Boer T.R., Palomino R.I., Mascharak P.K. Peroxynitrite-mediated dimerization of 3-nitrotyrosine: unique chemistry along the spectrum of peroxynitrite-mediated nitration of tyrosine. Med One. 2019; 4:e190003. doi: 10.20900/mo.20190003.
- Shah A.M. Inducible nitric oxide synthase and cardiovascular disease. Cardiovasc. Res. 2000;45(1):148-55. doi: 10.1016/s0008-6363(99)00316-8.
- Mungrue I.N., Gros R., You X., Pirani A., Azad A., Csont T. et al. Cardiomyocyte overexpression of iNOS in mice results in peroxynutrite generation, heart block, and sudden death. J. Clin. Invest. 2002;109(6):735-43. doi: 10.1172/JCI13265.
- Zhang P., Xu X., Hu X., van Deel E.D., Zhu G., Chen Y. iNOS deficiency protects the heart from systolic overload induced ventricular hypertrophy and congestive heart failure. 2007;100(7):1089-98. doi: 10.1161/01.RES.0000264081.78659.45.
- Lind M., Hayes A., Caprnda M., Petrovic D., Rodrigo L., Kruzliak P., Zulli A. Inducible nitric oxide synthase: Good or bad? Biomed Pharmacother. 2017;(93):370-375. doi: 10.1016/j.biopha.2017.06.036.
