Научно-медицинский вестник Центрального ЧерноземьяНаучно-медицинский вестник Центрального Черноземья1990-472XФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный медицинский университет имени Н.Н. Бурденко" Министерства здравоохранения Российской Федерации88610.18499/1990-472X-2006-0-24-6-12Original ArticleOTsENKA EKSPRESSII PROAPOPTIChESKOGO BAD I ANTIAPOPTIChESKOGO BCL-2 BELKOV V TKANYaKh PEChENI KRYS V OSTROM PERIODE POSLE OBShchEY UPRAVLYaEMOY GIPERTERMIIPakhomovaYu V-EfremovA V-MichurinaS V-ArkhipovS A-151220062461213032020Copyright © 2006, Научно-медицинский вестник Центрального Черноземья2006Известно, что в ходе реализации программы «запрограммированной гибели клеток» - апоптоза происходит элиминация клеток, выполнивших на определенном этапе развития свое функциональное значение и ставших ненужными, а также активное уничтожение клеток, подвергшихся мутации [1, 5, 8]. Особое значение при изучении апоптоза в настоящее время придается возможностям использования этого явления в целях терапии ингибирования или активации этого вида смерти клеток. Для заболеваний, связанных с замедлением апоптоза, в настоящий момент разрабатываются методы, способные ускорить этот процесс [9]. К числу таких методов относится и общая управляемая гипертермия (ОУГ), которая рассматривается некоторыми исследователями в качестве одной из перспективных медицинских инновационных технологий профилактики и терапии [2, 6]. Однако, роль апоптоза в патогенезе нарушений гомеостаза в остром периоде после ОУГ еще недостаточно изучена, что и позволило сформулировать цель настоящего исследования. Цель исследования: изучить соотношение процессов апоптоза и пролиферации в печени крыс в остром периоде после ОУГ. Материалы и методы. Исследования проведены на 169 крысах-самцах линии Wistar (возраст 2,5 мес.) массой 258,58 ± 14,06 г. Экспериментальные животные были разделены на 4 группы: 1 группа - контроль; 2 группа - 5 часов с момента перегревания; 3 группа - 1-е сутки с момента перегревания; 4 группа - 3-и сутки с момента перегревания. Разогревание крыс производилось в полном соответствии со «Способом экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных» [3] при погружении объекта исследования в горячую воду (45°С) до уровня шеи до достижения ректальной температуры 43,5°С (стадия теплового удара). Проапоптотический белок Bad и антиапоптотический белок Bcl-2 определяли на парафиновых срезах тканей печени с помощью иммуногистохимического метода, являющегося вариантом непрямого стрептавидин-авидинового метода [4]. Срезы изучали при помощи микроскопа MS300A (Австрия). Цифровые фотографии получали с помощью цифровой камеры Baumer optronic CX13c. Результаты и их обсуждение. В контрольной группе животных Bad-позитивное окрашивание препаратов было не выраженным. Экспрессия Bad-протеинов наблюдалась преимущественно в области синусоидальных клеток печени, эндотелиальной выстилке междольковых артерий, а также междольковых, центральных и поддольковых вен (рис. 1). Единичные паренхиматозные клетки печеночных долек давали Bad-позитивную окраску цитоплазмы. Результаты исследования свидетельствовали, что через 5 часов с момента перегревания наблюдалось усиление экспрессии семейства Bad-протеинов в эндотелиальной выстилке кровеносных синусоидных капилляров и располагающихся в них лимфоцитах (рис. 2). Одновременно с этим увеличивалось количество гепатоцитов, цитоплазма которых имела сродство к красителю, выявляющему проапоптотический белок, что свидетельствовало об активации процессов апоптоза. На 1-е сутки после ОУГ отмечалось усиление Bad-позитивного окрашивания в области отечной междольковой соединительной ткани и лимфатических щелях, особенно в междольковых артериях и венах в области триад. Наблюдалась значительная дилатация микроциркуляторного русла в печеночных дольках (рис. 3). На 3-и сутки после ОУГ наблюдалось интенсивное Bad-позитивное окрашивание значительной части цитоплазмы и ядер гепатоцитов (рис. 4). Рис. 1. Слабое Bad-позитивное окрашивание эндотелия сосудов печени интактных крыс. Об. х 40, ок. х 10 Рис. 2. Выраженное Bad-позитивное окрашивание синусоидальных клеток и лимфоцитов синусоидных капилляров печени крыс через 5 часов с момента ОУГ. Об. х 40, ок. х 10 Рис. 3. Выраженное Bad-позитивное окрашивание междольковой соединительной ткани и дилатация пространств лимфатических щелей печени крыс на 1-е сутки после ОУГ. Об. х 40, ок. х 10 Рис. 4. Выраженное Bad-позитивное окрашивание цитоплазмы гепатоцитов крыс на 3-и сутки после ОУГ. Об. х 40, ок. х 10 В контрольной группе наблюдалось Bcl-2-позитивное окрашивание гепатоцитов, особенно выраженное в области центральных вен и в синусоидальных клетках, составляющих выстилку кровеносных синусоидных капилляров печеночных долек. Также выявлялось выраженное Bcl-2-позитивное окрашивание эндотелиальной выстилки более крупных сосудов, как в области триад (междольковые артерии и вены), так и в области центральных и поддольковых вен (рис. 5). Через 5 часов с момента ОУГ было выявлено усиление иммуногистохимического окрашивания на выявление антиапоптотического белка Bcl-2, особенно выраженное в эндотелиальной выстилке междольковых и внутридольковых сосудов, клетках лимфоидного ряда и гепатоцитах (рис. 6). На 1-е сутки после перегревания было отмечено усиление сродства гепатоцитов к красителю. В этом сроке наблюдения возрастало число гепатоцитов, имевших Bcl-2-позитивное окрашивание (рис. 7). На 3-и сутки с момента ОУГ интенсивность окрашивания гепатоцитов особенно возрастала в области центральных вен. Выраженное Bcl-2-позитивное окрашивание выявлялось также в лимфоцитах и синусоидальных клетках, составлявших выстилку кровеносных синусоидных капилляров печеночных долек. Было отмечено интенсивное Bcl-2-позитивное окрашивание эндотелиальной выстилки крупных сосудов как в области триад (междольковые артерии и вены), так и в области центральных и поддольковых вен (рис. 8). Усиление экспресии Bcl-2-протеинов на 3-и сутки эксперимента свидетельствовало о стимуляции пролиферации клеток, блокирующих апоптоз и осуществляющих антиоксидантную защиту клеток, сигнализировало об «аварийности» ситуации, в которой находился организм в связи с риском реализации генетической программы «программируемой клеточной смерти», и отражало повышение резистентности клеток к апоптозу [7]. Таким образом, относительно высокий уровень экспрессии Bcl-2 в исследуемых тканях печени позволял судить об устойчивости клеток организма к проапоптотическим сигналам в остром периоде после ОУГ. Наблюдаемая одномоментная активация «молекулярных переключателей» апоптоза в постгипертермическом периоде иллюстрировала сбалансированность процессов апоптоза и пролиферации в печени на фоне действия экстремально высокой внешней температуры. Рис. 5. Слабое Bcl-2-позитивное окрашивание отдельных гепатоцитов в дольках печени и лимфоидных клетках у интактных крыс. Об. х 40, ок. х 10 Рис. 6. Выраженное Bcl-2-позитивное окрашивание в эндотелиальной выстилке междольковых кровеносных синусоидных капилляров и гепатоцитах крыс через 5 часов с момента ОУГ. Об. х 40, ок. х 10 Рис. 7. Выраженное Bcl-2-позитивное окрашивание гепатоцитов крыс на 1-е сутки после ОУГ. Об. х 40, ок. х 10 Рис. 8. Выраженное Bcl-2-позитивное окрашивание гепатоцитов, синусоидальных клеток печени крыс на 3-и сутки после ОУГ. Об. х 40, ок. х 10 Выводы. Результаты исследования свидетельствовали, что на протяжении всего острого постгипертермического периода выраженного нарушения динамического баланса между апоптозом и пролиферацией клеток печени не наблюдалось, напротив, с первых часов после ОУГ до 3-х суток эксперимента на фоне интенсификации процессов «запрограммированной гибели клеток» была выявлена повышенная митотическая активность гепатоцитов и увеличение количества диплокариоцитов. Ускорение элиминации клеток и интенсификация митотической активности делают возможным использование методики ОУГ в лечении заболеваний, связанных с замедлением процесса апоптоза.1.Браншите Т. А. Клинико-функциональные, морфологические и молекулярно-клеточные особенности развития кардиомиопатий : автореф. дис. … д-ра мед. наук / Т. А. Браншите. - М., 2003. - 48 с.2.Быкова Е. В., Некоторые патофизиологические аспекты гипертермической фармакотерапии и ее клиническое применение / Е. В. Быкова, В. П. Шевченко, М. Н. Лебедева // Анестезиология и реаниматология. - 2004. - № 4. - С. 70-71.3.Ефремов А. В. Патент 2165105 Российская Федерация. Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных / Ефремов А. В., Пахомова Ю. В., Пахомов Е. А., Ибрагимов Р. Ш., Шорина Г. Н.; опубл. 2001б, Бюл. № 10.4.Эллиниди В. Н. Практическая иммуногистохимия : метод. рек. / В. Н. Эллиниди, Н. В. Аникиева, Н. А. Максимова. - Спб., 2002. - 36 с.5.Рукша Т. Г. Апоптоз кератиноцитов и экспрессия периферических бензодиазепиновых рецепторов при псориазе : дис. … канд. мед. наук / Т. Г. Рукша. - Новосибирск, 2003. - 110 с.6.Шевченко В.П. Электроэнцефалографический мониторинг при общей управляемой гипертермии до 44°С / В. П. Шевченко, И. П. Верещагин, Е. В. Быкова // Анестезиология и реаниматология. - 2003. - № 1. - С. 38-41.7.Chen S. C. Hyperthermic pretreatment decreases microvascular protein leakage and attenuates hypotension in anaphylactic shock in rats / S. C. Chen, T. S. Lu // Microvasc. Res. - 2001. - Vol. 61, N 2. - P. 152-159.8.Fukuya Y. Effect of vitamin D3 on the increased expression ob Bcl-xL in psoriasis / Y. Fukuya, M. Higaki, Y. Higaki // Arch. Dermatol. Res. - 2002. - Vol. 293, N 12. - P. 620-625.9.Toyota N. Therapeutic efficacy and apoptosis and necrosis kinetics of doxorubicin compared with cis-platin, combined with whole-body hyperthermia in a rat mammary adenocarcinoma / N. Toyota, F. R. Strebel // Int. J. Cancer. - 1998. - Vol. 76, N. - Р. 499-505.