ISSLEDOVANIE STRUKTURNYKh SVOYSTV ERITROTsITOV NOVOROZhDENNYKh S POSTGIPOKSIChESKIMI OSLOZhNENIYaMI

Abstract

В динамике курса интенсивной терапии в кровяном русле новорожденных, находящихся в критическом состоянии на фоне развития гипоксии, установлено последовательное увеличение количества эритроцитов, имеющих скрытые структурные повреждения. Выявлен разнонаправленный характер химической модификации белковых компонентов плазматической мембраны. Показано, что при развитии постгипоксических осложнений у новорожденных эритроциты низкостойкой субпопуляции характеризуются высокой чувствительностью к действию эндо- и экзогенных факторов различной природы.

Full Text

Актуальность. Ежегодно в мире умирает более 5 млн новорожденных. В России причиной 40 % летальных исходов является внутриматочная гипоксия и асфиксия в родах [6]. Именно гипоксическое поражение плода и новорожденного, прежде всего его ЦНС, характеризуют состояние напряженности и адекватности адаптационных процессов в раннем постнатальном периоде. При этом создаются предпосылки для высокой заболеваемости новорожденного, а в перспективе у детей раннего возраста [7, 15] Эксперты полагают, что более 1 млн смертей новорожденных во всем мире можно было бы предотвратить, если бы на местах совершенствовалась технология первичной помощи сразу после рождения [6]. Разработка и внедрение в клиническую практику методов, позволяющих адекватно оценить динамику критического состояния новорожденного, позволит снизить частоту и тяжесть неблагоприятных последствий в организме ребенка, вызванных развитием гипоксии в неонатальный период. Показано, что при критических состояниях в условиях недостатка кислорода у новорожденного развивается оксидативный стресс, нарушаются метаболизм и функции клеток [5, 16]. Эффективным механизмом как стрессовой, так и строго специфической регуляции самых разнообразных процессов в норме и при патогенезе различной этиологии являются структурные перестройки клеточных мембран [3, 9]. В частности, важная роль в адаптации организма человека животных к условиям внешней среды принадлежит эритроцитам. Они обеспечивают интегральный отклик адаптационных систем организма на действие эндо- и экзогенных факторов [3]. С целью изучения структурных свойств эритроцитов в условиях гипоксии и постгипоксических осложнений новорожденных нами было проведено исследование осмотической и кислотной резистентности эритроцитов крови детей в динамике критического состояния. Материал и методы исследования. Исследование структурных свойств эритроцитов крови проведено у 15 новорожденных в динамике критического состояния, развитие которого сопровождалось гипоксией различной степени. В опытах были использованы суспензии отмытых эритроцитов, которые получали путем трехкратного центрифугирования (3000 об/мин) в физрастворе. С целью выявления скрытых структурных превращений в эритроцитах изучали кинетику гипоосмотического гемолиза при 0,55 % концентрации NaCl, что соответствует точке критической резистентности для клеток контроля. Интегральные эритрограммы регистрировали при постоянном значении рН = 6,8 с использованием установки, включающей фотоколориметр ФЭК-56М, цифровой вольтметр В7-20 и двухкоординатный регистратор ЛКД4-003 [4]. Анализ интегральных гипоосмотических эритрограмм проводили по следующим показателям: доля гемолизированных в гипотонической среде (0,55 % NaCl) эритроцитов за 2 и 30 мин (G, Gmax, % соответственно). Данные параметры характеризует количество клеток низкостойкой (G), а также средне- и высокостойкой субпопуляций (Gmax), имеющих скрытые структурные изменения. Кислотную резистентность эритроцита, позволяющую оценить величину гидрофобного барьера проницаемости белковых компонентов мембраны, определяли по следующим параметрам: константа максимальной скорости гемолиза (Kmax), указывающая на степень дифференцировки популяции эритроцитов по структурным свойствам; длительность латентной фазы (tлат, с), которая является мерой стойкости низкостойких клеток. Результаты исследования обрабатывали методами вариационной статистики с использованием параметрических критериев выборочной совокупности. Полученные результаты и их обсуждение. Методом гипоосмотического гемолиза установлено последовательное снижение резистентности эритроцитов периферической крови новорожденных к действию осмотических сил в динамике заболевания. Изменение кислотной стойкости различных субпопуляций эритроцитов напротив, имело разнонаправленный характер. По динамике значений основных показателей кислотных эритрограмм пациенты условно были разделены на 3 группы. К первой отнесены дети, у которых на фоне значительного повышения числа разрушенных в гипотонической среде эритроцитов параметры кислотного гемолиза в динамике курса интенсивной терапии не изменялись. Ко второй - новорожденные, у которых уменьшение осмотической стойкости клеток сопровождается понижением химической резистентностью низко-, средне- и высокостойких эритроцитов. Третью группу составили пациенты со сложной зависимостью между гипоосмотической и кислотной устойчивостями эритроцитов различных субпопуляций. Экспериментально установлено, что в момент поступления в отделение реанимации в условиях гипоксии в кровяном русле новорожденных к первой группы уже циркулируют 17 % эритроцитов, имеющих в мембране скрытые структурные повреждения. Причем, скрытые дефекты аккумулируются главным образом в мембранах клеток низкостойкой субпопуляции. На это указывает, с одной стороны, повышение значения величины G (%), характеризующей долю гемолизированных низкостойких эритроцитов (рис. 1). С другой стороны - отсутствие положительного приращение количества разрушенных клеток после их 30 минутной инкубации в гипотоническом растворе NaCl (рис. 2). За это время гемолизируют более высокостойкие структурно измененные эритроциты. После 3 - 7 дневного курса реабилитационной терапии в крови новорожденных регистрировали повышение числа эритроцитов, имеющих скрытые структурные нарушения в среднем в 2 раза относительно исходного. Значения величин G и Gmax составили 50 и 53 % соответственно (рис. 1, 2). Равное значение приращений данных параметров свидетельствуют об увеличении в кровяном русле больных числа низкостойких, структурно поврежденных эритроцитов. Рис. 1. Динамика величин G гипоосмотического гемолиза эритроцитов крови новорожденных, находящихся в критическом состоянии. Рис. 2. Динамика величин Gmax гипоосмотического гемолиза эритроцитов крови новорожденных, находящихся в критическом состоянии. Наряду с этим в мембранах клеток формируются как скрытые, так и явные нарушения. Этот факт подтверждают данные, полученные при изучении аутогемолитической стойкости эритроцитов крови новорожденных. Результаты экспериментов позволяют заключить, что после недельного курса интенсивной терапии в эритроцитарных мембранах происходят необратимые структурные изменения, приводящие к их лизису уже в физиологической среде. Таким образом, методом автоматической регистрации кинетических кривых осмотического гемолиза эритроцитов установлено, что у новорожденных в условиях гипоксии в динамике интенсивной терапии увеличивается число скрытых структурных нарушений в белково-липидном каркасе мембран главным образом эритроцитов низкостойкой субпопуляции. Известно, что при старении в эритроците снижается интенсивность гликолиза, и, как следствие, падает энергетический потенциал и меняется поверхностный заряд клетки, появляются дефектные комплексы олигосахаридов и интегральных белков на поверхности мембраны, меняется липидный состав бислоя, нарушается проницаемость клеток для ионов натрия, калия, кальция, снижается деформабильность клетки [2]. Указанные процессы повышают чувствительность и снижают устойчивость мембраны к действию эндо- и экзогенных факторов, например, таких как активные формы кислорода и продукты их реакций с компонентами биомембран, лекарственные препараты и другие. Методом автоматической регистрации кислотных эритрограмм, мембраны, не было выявлено изменений значений основных параметров кислотной резистентности в динамике пребывания новорожденных в отделении реанимации (рис. 3, 4). Результаты полученных данных могут быть обусловлены, с одной стороны, отсутствием изменения гидрофобного барьера проницаемости мембраны эритроцита на фоне модификации липидных компонентов. С другой стороны - формированием структурных нарушений как в липидах, так и в белках эритроцитов, которые сохраняются длительное время. Рис. 3. Динамика величин tlat кислотного гемолиза эритроцитов крови новорожденных, находящихся в критическом состоянии. Рис. 4. Динамика величин Kmax кислотного гемолиза эритроцитов крови новорожденных, находящихся в критическом состоянии. У пациентов второй группы после 2 и 30 минутной инкубации эритроцитов в гипотонической среде выявлен гемолиз 9 % и 10 % клеток соответственно (рис. 1, 2). Полученные данные сравнимы с контрольными значениями и свидетельствуют о небольшом количестве эритроцитов низкостойкой субпопуляции, имеющих скрытые структурные повреждения. После курса интенсивной терапии, продолжительность которого составила от 5 до 16 дней, зарегистрировано значительное снижение гипоосмотической резистентности клеток. Увеличение в 3 раза значения параметра G (рис. 1) свидетельствует о накоплении дефектов в мембранах низкостойких эритроцитов, а также о повышении количества таких клеток. Величина Gmax возросла в 4 раза относительно исходного значения (рис. 2). Это указывает на то, что процесс структурных модификаций эритроцитов, приводящий к снижению их резистентности, затрагивает как низко-, так и более высокостойкие клетки, то есть характеризуется меньшей специфичностью по отношению к начальной дифференцировке клеток по структурным свойствам. Методом кислотных эритрограмм установлено, что в ходе курса терапии в крови новорожденных протекают процессы химической модификации различных по стойкости субпопуляций эритроцитов, приводящие к снижению гидрофобного барьера проницаемости белков мембраны для протонов. На это указывают сокращение в динамике патологии длительности латентной фазы кислотного гемолиза эритроцитов (рис. 3), а также повышение величины Kmax (рис. 4). Результаты полученных данных методами кислотного и гипоосмотического гемолиза свидетельствуют о том, что у новорожденных данной группы в ходе курса реабилитационной терапии при гипоксии нарушается структурная организация, а вследствие этого и функционирование эритроцитов. Экспериментально установлено также, что наибольшей неспецифичностью по отношению к формированию изменений нативной структуры характеризуются белковые компоненты мембраны. Более высокая гипоосмотическая резистентность эритроцитов крови новорожденных 1 группы на первом этапе развития гипоксии по отношению к таковой детей 2 группы может явиться результатом различных процессов. Возможно, у детей 1 группы развитие гипоксии происходило уже внутриутробно или же патология характеризовалась высокой степенью тяжести. При этом за счет быстрого нарушения метаболических процессов происходила интенсивная модификация биомембраны, что отразилось в исходном снижении гипоосмотической стойкости эритроцитов. У детей второй группы начальный уровень тяжести патологического состояния был ниже, в результате чего в 0,55 % растворе NaCl гемолизировало меньшее количество клеток по сравнению с пациентами 1 группы. Эту гипотезу подтверждают данные, полученные методом кислотных эритрограмм. Установлено, что эритроциты как низко- и средне-, так и высокостойкой субпопуляций изначально характеризуются низком уровнем химической резистентности, который сохраняется на протяжении курса интенсивной терапии и лишь к его завершению становиться сравнимым с кислотной резистентностью для новорожденных 2 группы. В условиях гипоксии происходит усиление активности фосфолипаз, что, в конечном итоге, приводит к структурным и функциональным изменениям мембраносвязанных ферментов, вызванных действием продуктов гидролиза фосфолипаз [10]. При патологии усиление активности этих ферментов может сопровождаться потерей основных мембранных фосфолипидов, увеличением высвобождения свободных жирных кислот и накоплением перекисей липидов, то есть происходит индуцированное старение эритроцитов [13]. Одной из причин активации фосфолипаз являются процессы пероксидного окисления липидов (ПОЛ), протекающие с высокой скоростью в организме новорожденного на фоне пониженного антиоксидантного статуса [8, 14]. Усиление ПОЛ изменяет вязкость и состав липидов в мембране, являющимися важнейшими факторами, от которых зависит активность ферментов, встроенных в мембрану. Поэтому процессы свободно-радикального окисления (СРО), протекающие в бислое, оказывают непосредственное влияние на структурно- функциональные характеристики мембранных белков и ферментов, вызывая структурные нарушения белок-липидных комплексов [12]. Увеличение в динамике критического состояния в кровяном русле новорожденных числа эритроцитов, имеющих нарушения в структурной организации мембранного каркаса могут явиться следствием не только интенсификации реакций СР характера, но также и влиянием лекарственных препаратов, в частности различных классов антибиотиков. Кроме того, развитие оксидативного стресса в организме ребенка может инициировать также и применение аппаратов искусственной вентиляции легких [16]. У детей, отнесенных к третьей группе, в момент поступления в отделение реанимации гипоосмотическая резистентность эритроцитов сравнима с контролем. Однако, в динамике развития гипоксического состояния регистрировали накопление скрытых структурных повреждений в мембранах как низко-, так и более высокостойких клеток (значения величин G и Gmax увеличиваются на 19 и 14 % соответственно) (рис. 1, 2). По изменению основных параметров кислотных эритрограмм - Kmax и tlat пациенты третьей группы нами были разделены на две подгруппы. У новорожденных подгруппы III а на фоне постоянной в ходе курса лечения длительности величины tlat клеток (рис. 3) регистрировали повышение величины Kmax (рис. 4), а, следовательно, и степени структурной однородности популяции эритроцитов. Модификации белковых компонентов низкостойких клеток, вероятно, возникают уже в начальный период развития патологии и сохраняются длительное время. В то время как изменения мембраны средне- и более высокостойких эритроцитов, возможно, реализуются в динамике заболевания. Это отражается в повышении значений Kmax на 12 % относительно исходного уровня (рис. 4). В подгруппе b в период интенсивной терапии уменьшается гидрофобный барьер проницаемости для протонов эритроцитов низкостойкой субпопуляции (tlat сокращается на 16 %) (рис. 3) и увеличивается для мембран средне- и высокостойких субпопуляций клеток (Kmax понижается на 32 %) (рис. 4). Полученные данные могут быть обусловлены тем, что экзо- и эндогенные факторы первоначально оказывают повреждающее воздействие на низкостойкие эритроциты. Высокостойкие клетки имеют более жесткую организацию, поэтому модификаторы индуцируют в них структурные изменения иного характера, не вызывающие снижения кислотной резистентности. Выводы. Результаты проведенных исследований позволяют заключить, что на первом этапе развития критического состояния у некоторых новорожденных происходит формирование скрытых повреждений белково-липидного каркаса мембраны эритроцита. На фоне интенсивной терапии и развития постгипоксических осложнений регистрируется снижение резистентности клеток к действию осмотических сил вследствие аккумуляции структурных дефектов в различных по стойкости субпопуляциях эритроцитов. Методом кислотного гемолиза установлено, что химическая модификация белковых компонент мембраны эритроцитов новорожденных исследуемых групп вызывает разнонаправленный характер изменения гидрофобного барьера проницаемости клеток для протонов. По-видимому, это обусловлено индивидуальными различиями исходного липидного состава эритроцитов, обеспечивающего определенную «жесткость» мембраны, которая играет важную роль при адаптации новорожденных в условиях стресса [1]. Различная направленность модифицирующего эффекта может зависеть также и от особенностей компенсаторных реакций организма новорожденного, тяжести и характера патологии, а также назначения определенной лекарственной терапии. В совокупности указанные факторы определяют протекание в организме биохимических процессов, направленных на восстановление функционального состояния ребенка и поддержание гоместаза. Структурные перестройки оказывают глубокое влияние практически на все формы функциональной активности биологических мембран: активность внутримембранных ферментов; процессы проницаемости и транспорта ионов, сахаров; энергообразование и др. [10]. В связи с этим изменение структурной организации клеток является эффективным механизмом как стрессовой, так и строго специфической регуляции самых разнообразных процессов в норме и при адаптации организма в условиях патологии. По этой причине изменение структурных свойств эритроцитов может служить диагностическим критерием клинического и функционального состояния новорожденных, а изучение механизма формирования повреждений в мембране эритроцита является важным для понимания развития дефектов клеток других тканей и органов, а также при назначении лекарственной терапии [11]. Для изучения механизма возникновения структурных перестроек эритроцитарных мембран требуется комплексный анализ изменения различных параметров, характеризующих структурно-функциональное состояние отдельных биоструктур и организма в целом, а также воздействующих на него факторов.