THE INFLUENCE OF ANTIOXIDANTS ON THE INDUCTION OF MICRONUCLEI IN RATS’ BLOOD ERYTHROCYTES IN CHEMOTHERAPY AND GAMMA IRRADIATING

Full Text

Актуальность. Проблема репродуктивного здоровья была и остается одной из самых острых в медицине. Расстройства репродуктивной системы могут проявляться в форме снижения фертильности, приводить к нарушениям менструальной функции, эмбрио- и фетопатиям, патологии беременности и родов, увеличению материнской и детской смертности. Причины снижения активности яичников у женщин до 40 лет сложны, и зачастую представляют собой сочетание психических, токсических, инфекционных, и генетических факторов [1]. Таким образом актуальной является разработка своевременных профилактических и лечебных мероприятий, позволяющих снизить риск, или, в некоторых случаях, избежать необратимых поражений репродуктивной системы. Различные экспериментальные модели овариального дефицита, вызванные радиационным воздействием, индуцируемые стрессом, алкилирующими и другими токсическими агентами, удобны для изучения воздействия новых лекарственных средств и способов предупреждения развития и лечения овариального дефицита. Оценка эффективности защитного действия различных средств на репродуктивную систему в эксперименте является длительным, комплексным, дорогим и трудоемким процессом. В нашей работе мы изучали возможность косвенной оценки активности протекторных средств, которая позволила бы проводить предварительные скрининговые исследования фармакологической активности с наименьшими потерями. В качестве метода оценки воздействия исследуемых факторов был выбран микроядерный тест эритроцитов периферической крови. Микроядра - хроматиновые образования, находящиеся внутри клетки. Они могут появляться в результате отставания отдельных хромосом и их фрагментов, могут образовываться также в результате деструкции ядра и апоптоза клетки или в процессе освобождения клетки от лишнего хроматина, после мутационного воздействия. В микроскопе микроядра видны как небольшие округлые, без острых граней, но с четким контуром, густо окрашенные тельца. Находятся микроядра обычно ближе к периферии в фокусе, когда четко виден контур эритроцитов [2]. Микроядерный тест является общепринятым цитогенетическим методом оценки мутагенного действия агентов различной природы. С его помощью проводиться тестирование на мутагенную активность большого числа химических, физических и биологических агентов, тест применяется уже на первом этапе проверки потенциальных мутагенов и канцерогенов. Нашел свое применение данный тест и в различных областях практической медицины, исследований теоретического и прикладного характера [3-7]. Таким образом целью данного исследования явилось сравнение экспериментальных моделей овариального дефицита с помощью микроядерного теста эритроцитов периферической крови крыс. Материал и методы исследования. Все манипуляции с животными выполнялись в соответствии с принципами биоэтики, правилам лабораторной практики (GLP) и этическим нормам, изложенным «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985). В эксперименте участвовало 54 половозрелых самок крыс породы Wistar массой 155-165 г., которых разделили на 3 группы: 1) контрольная группа, 2) группа, подвергшаяся облучению, 3) группа, подвергшаяся действию циклофосфамида. Для выявления случайной беременности, крысы прошли 21-дневный карантин. В ходе эксперимента животные находились в условиях стандартного светового режима дня, на классическом пищевом рационе (гранулированный корм), без ограничения доступа к воде. В течение 21дня карантина и на протяжении всего эксперимента у всех крыс изучали эстральный цикл. Мазок забирали пластиковой пипеткой, содержащей 0,1 мл изотонического раствора натрия хлорида. Троекратный смыв из влагалища наносили на предметное стекло. Мазки 5-6 минут фиксировали смесью (1:1) эфира диэтилового и спирта, и затем окрашивали метиленовым синим. Краситель смывали водой спустя 20 мин, препарат на 1-2 часа оставляли для подсушки на воздухе. Далее под микроскопом (ОАО «ЛОМО», г. Санкт-Петербург) изучали мазок, определяя фазы эстрального цикла по составу клеток содержимого влагалища. Полученные данные сравнивали в фазах ЭЦ проэструс / эструс и диэструс ½ . Изучение эстрального цикла крыс до начала эксперимента показало наличие у 80 % животных нормального овуляторного цикла, включающего 4 фазы: диэструс (стадия покоя, или межтечки); проэструс (стадия подготовки к течке, или предтечки); эструс (течка); метэструс (стадия послетечки). Животных с отсутствием регулярного эстрального цикла (6 крыс) исключили из эксперимента. Для воспроизведения овариального дефицита было выбрано две модели. Для моделирования циклофосфамид-индуцированного дефицита (ЦИОД) животным вводили циклофосфамид внутрибрюшинно однократно в дозе 200 мг/кг в первый день, и затем в дозе 8 мг\\кг в день последующие 14 дней. Альтернативной моделью служил овариальный дефицит, индуцированный облучением животных (ГИОД), на гамма-терапевтическом аппарате Teragam, источник Кобальт-60, однократная доза 3,2 Гр. Изучаемые антиоксидантные композиции вводились во всех группах животных ежедневно перорально через зонд, в объеме 0,5 мл на протяжении 14 дней до начала моделирования овариального дефицита. В конечной точке эксперимента животные подвергались эвтаназии, кровь брали из брюшной аорты. Для оценки генетической стабильности крыс с помощью микроядерного теста взятие периферической крови проводили в остром опыте на крысах. После чего мазок наносился чистое сухое предметное стекло и фиксировался в 96-% этиловом спирте 1-2 минуты. Окрашивание препарата осуществляли азур-эозином по Романовскому-Гимза. От каждого животного было взято по 2 препарата, то есть опыт проводился в двух повторностях. Препараты анализировали с помощью светового микроскопа при увеличении 100×1,5×10. На каждом препарате было просмотрено не менее 3000 эритроцитов и вычислена частота встречаемости эритроцитов с микроядрами как отношение числа клеток с микроядрами к общему числу проанализированных клеток (в ‰) [2]. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета статистических программ «Stadia». Сравнение медиан выборок осуществляли с использованием непараметрического Х-критерия Ван-дер-Вардена, так как распределение частоты встречаемости клеток с микроядрами не подчиняется нормальному закону. Процедура группировки данных и их обработка изложены в работе Кулаичева [8]. Полученные результаты и их обсуждение. В результате проведенных исследований было показано, что овариальный дефицит, индуцированный облучением животных, оказывает влияние на генетическую стабильность животных. Так в периферической крови облученных животных было выявлено более высокое содержание эритроцитов с микроядрами (1,47±0,08), чем в контрольной группе животных, не подвергавшихся облучению (0,53±0,04) (Р<0,01) (рис. 1). Следует отметить, что введение антиоксидантных композиции после облучения не вызвало достоверного снижения частоты эритроцитов с микроядрами. При этом выявлено, что у крыс, подвергавшихся воздействию после облучения антиоксидантной композицией АО1 было меньше эритроцитов с нарушениями (1,28±0,20), чем у крыс, которые после облучения подверглись воздействию сложной антиоксидантной композицией М5 (1,61±0,08) (Р<0,05). Влияния циклофосфамида на частоту встречаемости эритроцитов с микроядрами зарегистрировано не было. Рис. 2. Частота встречаемости эритроцитов с микроядрами в периферической крови крыс под воздействием различных факторов Обозначения: а - различие с частотой встречаемости эритроцитов с микроядрами у группы, подвергшейся воздействию циклофосфамида, достоверно (Р<0,05); б - различие с частотой встречаемости эритроцитов с микроядрами у группы, подвергшейся воздействию циклофосфамида, достоверно (Р<0,01); в - различие с частотой встречаемости эритроцитов с микроядрами у группы, подвергшейся воздействию циклофосфамида и антиоксидантной композиции М5, достоверно (Р<0,05); г - различие с частотой встречаемости эритроцитов с микроядрами у группы, подвергшейся воздействию циклофосфамида и антиоксидантной композиции М5, достоверно (Р<0,01); д - различие с частотой встречаемости эритроцитов с микроядрами в контрольной группе достоверно (Р<0,05); е - различие с частотой встречаемости эритроцитов с микроядрами в контрольной группе достоверно (Р<0,01); ж - различие с частотой встречаемости эритроцитов с микроядрами у группы, подвергшейся воздействию облучения и антиоксидантной композиции М5, достоверно (Р<0,05). Выводы. Таким образом можно заключить, что гамма-индуцированное облучение оказывает более сильное негативное влияние на генетическую стабильность организма, чем циклофосфамид-индуцированное воздействие. Модулирующего влияния антиоксидантных композиций сложного состава при этом не отмечено. Мы можем рекомендовать микроядерный тест периферической крови, как метод сравнения экспериментальных моделей овариального дефицита крыс.

About the authors

M. S Nechaeva

Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko

N. S Preobrazhenskaya

Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko

N. Yu Gudkov

Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko

D. E Shchedrin

Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko

References