STUDY OF BLOOD CHEMILUMINESCENCE AND OPTICAL RADIATION USED IN FOTOHEMOTHERAPY EFFECTING IT

Full Text

Актуальность. Исследование окислительно-восстановительных и свободнорадикальных реакций широко используется в медицине для изучения течения тех или иных патологических процессов. Особое значение они имеют при исследовании механизмов лечебного действия фотогемотерапии (ФГТ), так как при взаимодействии квантового излучения и биологического объекта большую роль играют реакции образования активных форм кислорода, перекисного фотоокисления липидов (ПФОЛ) и антиоксидантной защиты [3, 8, 9]. К сожалению, активные формы кислорода и свободные радикалы обладают столь высокой реактогенностью и малой продолжительностью жизни, что их невозможно анализировать обычными биохимическими методами [1]. Приходится использовать косвенные методы, основанные на анализе конечных, более стойких, продуктов реакции, таких как малоновый диальдегид (МДА) и др. Одним из появившихся в последнее время прямых методов изучения свободных радикалов, активных форм кислорода и реакций, в которых они участвуют, является метод изучения собственной и активированной хемилюминесценции (ХЛ) клеток крови [1]. Собственная ХЛ, сопровождающая окислительно-восстановительные реакции, характеризуется низкой интенсивностью, поэтому удобнее изучать ХЛ в присутствии активаторов, усиливающих свечение во много раз, наиболее популярным из которых является люминол. Однако в доступной нам литературе при изучении ХЛ крови определяется в основном кинетика процесса и интегральная светимость [1, 6, 7]. Хотя в многокомпонентной биологической системе, какой является кровь человека, наряду с процессами ХЛ, обязательно будут протекать и процессы поглощения образующегося излучения, и вторичной фотолюминесценции (ФЛ) молекул среды. В этом случае и кинетика свечения, и интегральная светимость во многом будут определяться именно этими превращениями. Кроме того, ХЛ достаточно капризная реакция, крайне чувствительная к изменению рН среды и посторонним примесям. Поэтому нам показалось интересным изучать не только количественные характеристики, но и спектр свечения. Материал и методы исследования. Для исследования биолюминесценции нашими кафедрами совместно была создана установка, позволяющая изучать как кинетику, так и спектральные характеристики активированной ХЛ и ФЛ биологических объектов (рис.1). Рис.1. Блок-схема установки для изучения биолюминесценции. Свечение исследуемого образца (Об), помещенного в термостатируемую кварцевую кювету, регистрируется светочувствительным датчиком (ФЭУ-79), импульсы которого усиливаются электрической схемой установки, работающей по наиболее чувствительному методу «счета фотонов», и поступают на регистрирующее устройство (ЧМ1). Исследование спектра излучения достигается использованием монохроматора (М1), а облучение образца и возбуждение ФЛ - широкополосным источником (И1) с комплектом светофильтров (Ф1). На описанной установке нами проведены измерения: • кинетики и спектра стимулированной кристаллами ВаSО4 [2] ХЛ цельной крови в присутствии люминола при 37ОС, характеризующих интенсивность окислительно-восстановительных процессов и наличие активных форм О2; • тушения ХЛ стандартной системы (Hb+Н2О2+люминол) плазменными факторами антиоксидантной защиты (при t=37OC); • спектра ФЛ плазменных белков (при t=20ОС) - результаты опубликованы ранее [5]. Исследовалась кровь здоровых доноров (n=16) и кровь больных, страдающих сахарным диабетом (СД), осложненным синдромом «диабетической стопы» с выраженными гемореологическими нарушениями (n=18). Исследование проводилось до и сразу после однократного облучения крови обычными дозами оптического излучения основных аппаратов для ФГТ, использующихся в клинической практике: коротковолновый УФ 254нм («Изольда» МД73М); длинноволновый УФ 365нм (ОКУФЭ «Юлия»); красный свет люминесцентной лампы 612нм («Юлия» ЛК-6); красное лазерное излучение 633нм («ШАТЛ-АЭЛОК»). Полученные результаты и их обсуждение. При изучении кинетики и спектра ХЛ цельной крови здоровых доноров и больных СД, отмечено, что при патологии уровень ХЛ уменьшается до 1386+/-218 усл.ед. против 2088+/-241 усл.ед. у доноров (p<0,05); свечение разгорается более медленно - максимум на 22 сек. против 10 сек. у здоровых лиц, а затухает быстрее (93+/-14 сек. против 168+/-22 сек.); спектр его несколько смещен в коротковолновую область - 463 и 457нм соответственно (рис.2). Рис.2. Поверхность хемилюминесценции больного СД (А) и донора (Б). Второй пик ХЛ на рисунке получен добавлением на 100сек. в исследуемую среду ионов ОН-, он не зависит от обменных процессов в клетках, характеризует базовый уровень свечения системы и используется для контроля. Полученные изменения, на наш взгляд, характеризуют снижение уровня обменных процессов, а соответственно и генерации активных форм кислорода у обследованной категории больных. Для изучения активности плазменных факторов антиоксидантной защиты нами применена реакция тушения ХЛ в растворе, содержащем свободный Hb и Н2О2. Если перекись водорода разлагается ферментативным путем, например, при действии каталазы, свободные радикалы не образуются и свечения не возникает. В присутствии ионов металлов переменной валентности, таких как Fe, Cu или Mn, а также некоторых их комплексов, например, производных гема, перекись водорода разлагается с образованием свободных радикалов (гидроксила и супероксида) и возникает яркая ХЛ. При включении в такую систему плазменных белков начинается инактивация ими свободных радикалов и уменьшение свечения, пропорциональное антиоксидантной активности исследуемой плазмы. Мы отметили значительно более выраженное тушение ХЛ при добавлении плазмы здорового человека, чем страдающего СД (рис.3.), что подчеркивает факт снижения процессов антиоксидантной защиты у больных с данной патологией и обосновывает необходимость назначения им соответствующей терапии. Рис.3. Тушение ХЛ плазмой больного СД (А) и донора (Б). При изучении влияния оптического излучения различных источников, использующихся для ФГТ на процессы образования активных радикалов методом ХЛ (рис.4.) нами установлено, что предварительное облучение крови УФ-лучами вызывает заметное усиление ХЛ, особенно на длине волны 365нм. Очевидно, достаточно жесткое УФ излучение активизирует процесс ПОЛ и увеличивает количество свободных радикалов, что необходимо помнить при назначении УФО крови. Напротив, более мягкое излучение в красной области, как лазерное (633нм), так и люминесцентное (612нм), приводит к некоторому снижению свечения. Это подтверждает литературные данные [4, 9] об активации супероксиддисмутазы излучением He-Ne лазера в красной области спектра. Рис.4. Влияние облучения крови оптическим излучением различной длины волны на интенсивность ХЛ. Выводы. 1. Изучение кинетики и спектра активированной ХЛ является информативным методом оценки активности окислительно-восстановительных реакций, количества свободнорадикальных продуктов и эффективности антиоксидантной защиты. 2. У больных СД, осложненным «синдромом диабетической стопы» на фоне гемореологических расстройств отмечается снижение уровня окислительно-восстановительных реакций и истощение антиоксидантной защиты. 3. Применение ФГТ в УФ-области приводит увеличению уровня свободных радикалов, видимо за счет активации ПОЛ, в то время как ФГТ в красной области ведет к их снижению, очевидно за счет реактивации супероксиддисмутазы.

About the authors

A S Yefimov

Voronezh State Medical University

M A Yefimova

Voronezh State Medical University

V A Beloshevskiy

Voronezh State Medical University

N V Shapovalova

Voronezh State Medical University

References