ASSESSMENT OF DNA DAMAGE IN MAMMALIAN CELLS IN VIVO INDUCED BY GLYPHOSATE

Full Text

Актуальность. Препараты на основе глифосата, N-(фосфонометил)-глицина, применяются в качестве гербицидов широкого спектра действия в течение нескольких десятилетий. На протяжении всего периода использования глифосата его считали малотоксичным веществом, не обладающим мутагенными и канцерогенными свойствами [11]. В 2015 году Международное агентство по изучению рака (МАИР) классифицировало глифосат как «вероятный канцероген для человека» (группа 2A) [6]. Кроме того, в заключении МАИР указано, что получены веские доказательства того, что действующее вещество глифосат и препаративные формы на его основе обладают генотоксичностью. Однако в Европе в 2017 году глифосат прошел перерегистрацию на срок 5 лет с некоторыми дополнительными требованиями, направленными на минимизацию его использования в общественных местах и обеспечение безопасного применения. В ноябре 2017 года Комиссией по канцерогенным факторам при Роспотребнадзоре было принято решение об отнесении глифосата к подклассу 2C по классификации канцерогенности пестицидов [2]. Канцерогенные вещества в большинстве случаев обладают мутагенной активностью, поэтому краткосрочные тесты в отношении генотоксичности могут быть использованы не только для выявления генотоксикантов, но и как прогностические в отношении потенциальной канцерогенности таких веществ. Целью настоящей работы было исследование способности технического продукта глифосата вызывать повреждения в молекулах ДНК в клетках костного мозга и печени млекопитающих методом «ДНК-комет». Материал и методы исследования. Исследования проводили на мышах линии CD1 обоих полов. Животных получали из питомника Филиала «Андреевка» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» Федерального медико-биологического агентства России. Тестировали технический продукт глифосат-кислоты с содержанием действующего вещества более 95%. Введение глифосата осуществляли внутрижелудочно 2 раза с интервалом 24 часа. В качестве отрицательного контроля использовали 1% крахмал. Положительным контролем служил метилметансульфонат (40 мг/кг), который вводили внутрибрюшинно один раз параллельно со вторым введением глифосата. Мышей умерщвляли через 3 часа после последней обработки методом цервикальной дислокации. Извлекали бедренные кости, из которых аспирировали костный мозг, и небольшие кусочки печени (массой 100-200 мг), которые подвергали гомогенизации. Получали суспензии клеток в фосфатном буфере, содержащем 10% ДМСО и 20 мМ ЭДТА-Na2. Подготовку микропрепаратов (по 2 стекла на каждую ткань каждого животного), лизис и денатурацию осуществляли, как описано в [1]. Электрофорез проводили в течение 20 минут (300 мА, 24 В) при 7C в камерах для электрофореза CSL-COM20 (Cleaver Scientific, Великобритания), используя охладитель для электрофоретических систем CSL-CHILLER (Cleaver Scientific, Великобритания). Микропрепараты повергали нейтрализации в буфере PBS и дегидратации в 75% растворе этанола. Сушили на воздухе и красили SYBR Green I в течение 30 минут. Микроскопический анализ проводили на эпифлюоресцентном микроскопе (Nikon Eclipse Ni-U, Япония), оснащенном камерой scA1300-32fm и программой для захвата изображения. Анализ ДНК-комет осуществляли с помощью программы анализа изображений Comet Assay IV (Perceptive Instruments Ltd, Великобритания). На каждом микропрепарате считали не менее 75 клеток (150 клеток на каждую ткань каждого животного). В качестве показателя повреждений ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте кометы (%ДНКхвт). Статистическую обработку данных проводили с помощью построения 99% доверительных интервалов обобщенной линейной модели (α = 0,01) для зависимой переменной lg %ДНКхв. и факторов доза и пол [12, 8], используя программу SPSS Statistics v. 22.0 (Корпорация IBM, Нью Йорк, США). Анализы данных для разного типа тканей (костный мозг и печень) осуществлялись независимо. Полученные результаты и их обсуждение. В исследовании использовали 10 групп мышей линии CD-1 обоих полов (по 4 мыши одного пола на группу): 2 группы (самцы и самки) отрицательного контроля, получавшие наполнитель (1% крахмал), 2 группы положительного контроля, получавшие 40 мг/кг массы тела метилметансульфоната, и 6 экспериментальных групп (3 группы самцов и 3 группы самок), получавшие глифосат в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг массы тела. Оценка повреждений ДНК с использованием щелочного кометного анализа в группах мышей отрицательного контроля показала, что процентное содержание ДНК в хвосте комет не превышало 1,4% в образцах костного мозга и 6,0% в образцах печени. В группах животных положительного контроля оцениваемый показатель составлял в среднем 35,0% в случае костного мозга и 42,3% в случае печени. Построение обобщенной линейной модели показало, что пол не являлся значимым фактором для показателя %ДНК в хвосте комет ни в случае костного мозга (p = 0,229), ни в случае печени (p = 0,898) при α = 0,01. Для корректной статистической обработки результатов полученные значения показателя %ДНКхв. были преобразованы в значения lg %ДНКхв. согласно рекомендациям OECD №489 [10]. Метод построения 99% доверительных интервалов (ДИ) профильного правдоподобия в рамках обобщенной линейной модели показал, что значения отношения lg%ДНК в опыте к lg%ДНК в контроле (lg%ДНКхв.опыт/ lg%ДНКхв.контр.) в образцах костного мозга мышей, обработанных глифосатом в дозах 500 и 1000 мг/кг м.т., значимо не отличались от значений для группы отрицательного контроля. Однако в случае дозы 2000 мг/кг м.т. обнаружено статистически значимое повышение такого показателя при α = 0,01 по сравнению с отрицательным контролем. При этом глифосат не оказывал значимого генотоксического действия на ДНК в клетках печени при α = 0,01. Данные статистического анализа представлены в таблице 1 и на рисунке 1. В таблице наряду с результатами оценки относительных величин приведены абсолютные значения и доверительные интервалы для среднего %ДНК в хвосте комет. Таблица 1. Результаты анализа мутагенной активности глифосата методом ДНК-комет in vivo. Доверительные интервалы (ДИ) средних значений %ДНКхв и значений отношения lg%ДНКопыт/ lg%ДНКконтроль. Ткань Параметр ДИ Доза (мг/кг массы тела) 0 500 1000 2000 Костный мозг нижняя граница . 0,643 0,519 1,607 среднее 1 0,988 0,798 2,469* верхняя граница . 1,517 1,226 3,793 нижняя граница 0,681 1,11 1,088 1,299 среднее 1,177 1,174 1,139 1,494* верхняя граница 2,034 1,28 1,221 1,853 Печень нижняя граница . 0,337 0,433 0,685 среднее 1 0,638 0,819 1,295 верхняя граница . 1,207 1,549 2,45 нижняя граница 1,328 1,66 1,918 2,803 среднее 4,502 2,611 3,429 7,017 верхняя граница 15,053 6,147 10,282 39,882 * Односторонняя значимость по сравнению с дозой 0 при α = 0,01; Рис. 1. График рассеивания точек lg%ДНК в хвосте для клеток костного мозга и печени мышей. Имеющиеся в литературе данные о генотоксической активности глифосата противоречивы. Глифосат не индуцировал мутации у бактерий Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и Escherichia coli [7]. В экспериментах in vitro на лимфоцитах человека при действии глифосата выявлены разрывы ДНК [3] и повышенный уровень сестринских хроматидных обменов [5], но не обнаружено индукции хромосомных аберраций и образования микроядер [4]. В тестах in vivo показано повреждающее ДНК действие в клетках печени и почек [9] и цитогенетические нарушения в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей [7]. Одной из причин различий в полученных результатах может быть использование для анализа разных технических продуктов, в которых содержание мутагенных примесей (например, N-нитрозоглифосата и формальдегида) может отличаться. Выводы. Полученные нами результаты показывают, что исследуемый технический продукт глифосата кислоты при пероральном поступлении в организм млекопитающих в высоких дозах может проявлять слабую мутагенную активность, и свидетельствуют о необходимости оценки генотоксичности всех поступающих в Российскую Федерацию пестицидов-аналогов.

About the authors

N A Ilyushinaa

Federal Scientific Center of Hygiene named after F. F. Erisman

G V Masaltsev

Federal Scientific Center of Hygiene named after F. F. Erisman

N S Averianova

Federal Scientific Center of Hygiene named after F. F. Erisman

References