ASSESSMENT OF DNA DAMAGE IN MAMMALIAN CELLS IN VIVO INDUCED BY GLYPHOSATE

Abstract


Protection and Human Wellbeing, Mytishchi, Russia Glyphosate is a widely used herbicide around the world. However, the International Agency for Research on Cancer classified glyphosate as "a probable human carcinogen" (group 2A) on basis of new data on genotoxicity and carcinogenicity of glyphosate that emerged in recent years. The results of the genotoxic activity estimation of the glyphosate acid technical product in the tissues of CD-1 mice by the DNA comet method are presented in the article. It was demonstrated that glyphosate induced DNA damage in bone marrow cells at the highest dose (2000 mg/kg body weight). The effects observed in the liver cells were statistically insignificant. The obtained data indicate a weak genotoxic activity of the investigated technical product glyphosate.

Актуальность. Препараты на основе глифосата, N-(фосфонометил)-глицина, применяются в качестве гербицидов широкого спектра действия в течение нескольких десятилетий. На протяжении всего периода использования глифосата его считали малотоксичным веществом, не обладающим мутагенными и канцерогенными свойствами [11]. В 2015 году Международное агентство по изучению рака (МАИР) классифицировало глифосат как «вероятный канцероген для человека» (группа 2A) [6]. Кроме того, в заключении МАИР указано, что получены веские доказательства того, что действующее вещество глифосат и препаративные формы на его основе обладают генотоксичностью. Однако в Европе в 2017 году глифосат прошел перерегистрацию на срок 5 лет с некоторыми дополнительными требованиями, направленными на минимизацию его использования в общественных местах и обеспечение безопасного применения. В ноябре 2017 года Комиссией по канцерогенным факторам при Роспотребнадзоре было принято решение об отнесении глифосата к подклассу 2C по классификации канцерогенности пестицидов [2]. Канцерогенные вещества в большинстве случаев обладают мутагенной активностью, поэтому краткосрочные тесты в отношении генотоксичности могут быть использованы не только для выявления генотоксикантов, но и как прогностические в отношении потенциальной канцерогенности таких веществ. Целью настоящей работы было исследование способности технического продукта глифосата вызывать повреждения в молекулах ДНК в клетках костного мозга и печени млекопитающих методом «ДНК-комет». Материал и методы исследования. Исследования проводили на мышах линии CD1 обоих полов. Животных получали из питомника Филиала «Андреевка» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» Федерального медико-биологического агентства России. Тестировали технический продукт глифосат-кислоты с содержанием действующего вещества более 95%. Введение глифосата осуществляли внутрижелудочно 2 раза с интервалом 24 часа. В качестве отрицательного контроля использовали 1% крахмал. Положительным контролем служил метилметансульфонат (40 мг/кг), который вводили внутрибрюшинно один раз параллельно со вторым введением глифосата. Мышей умерщвляли через 3 часа после последней обработки методом цервикальной дислокации. Извлекали бедренные кости, из которых аспирировали костный мозг, и небольшие кусочки печени (массой 100-200 мг), которые подвергали гомогенизации. Получали суспензии клеток в фосфатном буфере, содержащем 10% ДМСО и 20 мМ ЭДТА-Na2. Подготовку микропрепаратов (по 2 стекла на каждую ткань каждого животного), лизис и денатурацию осуществляли, как описано в [1]. Электрофорез проводили в течение 20 минут (300 мА, 24 В) при 7C в камерах для электрофореза CSL-COM20 (Cleaver Scientific, Великобритания), используя охладитель для электрофоретических систем CSL-CHILLER (Cleaver Scientific, Великобритания). Микропрепараты повергали нейтрализации в буфере PBS и дегидратации в 75% растворе этанола. Сушили на воздухе и красили SYBR Green I в течение 30 минут. Микроскопический анализ проводили на эпифлюоресцентном микроскопе (Nikon Eclipse Ni-U, Япония), оснащенном камерой scA1300-32fm и программой для захвата изображения. Анализ ДНК-комет осуществляли с помощью программы анализа изображений Comet Assay IV (Perceptive Instruments Ltd, Великобритания). На каждом микропрепарате считали не менее 75 клеток (150 клеток на каждую ткань каждого животного). В качестве показателя повреждений ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте кометы (%ДНКхвт). Статистическую обработку данных проводили с помощью построения 99% доверительных интервалов обобщенной линейной модели (α = 0,01) для зависимой переменной lg %ДНКхв. и факторов доза и пол [12, 8], используя программу SPSS Statistics v. 22.0 (Корпорация IBM, Нью Йорк, США). Анализы данных для разного типа тканей (костный мозг и печень) осуществлялись независимо. Полученные результаты и их обсуждение. В исследовании использовали 10 групп мышей линии CD-1 обоих полов (по 4 мыши одного пола на группу): 2 группы (самцы и самки) отрицательного контроля, получавшие наполнитель (1% крахмал), 2 группы положительного контроля, получавшие 40 мг/кг массы тела метилметансульфоната, и 6 экспериментальных групп (3 группы самцов и 3 группы самок), получавшие глифосат в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг массы тела. Оценка повреждений ДНК с использованием щелочного кометного анализа в группах мышей отрицательного контроля показала, что процентное содержание ДНК в хвосте комет не превышало 1,4% в образцах костного мозга и 6,0% в образцах печени. В группах животных положительного контроля оцениваемый показатель составлял в среднем 35,0% в случае костного мозга и 42,3% в случае печени. Построение обобщенной линейной модели показало, что пол не являлся значимым фактором для показателя %ДНК в хвосте комет ни в случае костного мозга (p = 0,229), ни в случае печени (p = 0,898) при α = 0,01. Для корректной статистической обработки результатов полученные значения показателя %ДНКхв. были преобразованы в значения lg %ДНКхв. согласно рекомендациям OECD №489 [10]. Метод построения 99% доверительных интервалов (ДИ) профильного правдоподобия в рамках обобщенной линейной модели показал, что значения отношения lg%ДНК в опыте к lg%ДНК в контроле (lg%ДНКхв.опыт/ lg%ДНКхв.контр.) в образцах костного мозга мышей, обработанных глифосатом в дозах 500 и 1000 мг/кг м.т., значимо не отличались от значений для группы отрицательного контроля. Однако в случае дозы 2000 мг/кг м.т. обнаружено статистически значимое повышение такого показателя при α = 0,01 по сравнению с отрицательным контролем. При этом глифосат не оказывал значимого генотоксического действия на ДНК в клетках печени при α = 0,01. Данные статистического анализа представлены в таблице 1 и на рисунке 1. В таблице наряду с результатами оценки относительных величин приведены абсолютные значения и доверительные интервалы для среднего %ДНК в хвосте комет. Таблица 1. Результаты анализа мутагенной активности глифосата методом ДНК-комет in vivo. Доверительные интервалы (ДИ) средних значений %ДНКхв и значений отношения lg%ДНКопыт/ lg%ДНКконтроль. Ткань Параметр ДИ Доза (мг/кг массы тела) 0 500 1000 2000 Костный мозг нижняя граница . 0,643 0,519 1,607 среднее 1 0,988 0,798 2,469* верхняя граница . 1,517 1,226 3,793 нижняя граница 0,681 1,11 1,088 1,299 среднее 1,177 1,174 1,139 1,494* верхняя граница 2,034 1,28 1,221 1,853 Печень нижняя граница . 0,337 0,433 0,685 среднее 1 0,638 0,819 1,295 верхняя граница . 1,207 1,549 2,45 нижняя граница 1,328 1,66 1,918 2,803 среднее 4,502 2,611 3,429 7,017 верхняя граница 15,053 6,147 10,282 39,882 * Односторонняя значимость по сравнению с дозой 0 при α = 0,01; Рис. 1. График рассеивания точек lg%ДНК в хвосте для клеток костного мозга и печени мышей. Имеющиеся в литературе данные о генотоксической активности глифосата противоречивы. Глифосат не индуцировал мутации у бактерий Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и Escherichia coli [7]. В экспериментах in vitro на лимфоцитах человека при действии глифосата выявлены разрывы ДНК [3] и повышенный уровень сестринских хроматидных обменов [5], но не обнаружено индукции хромосомных аберраций и образования микроядер [4]. В тестах in vivo показано повреждающее ДНК действие в клетках печени и почек [9] и цитогенетические нарушения в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей [7]. Одной из причин различий в полученных результатах может быть использование для анализа разных технических продуктов, в которых содержание мутагенных примесей (например, N-нитрозоглифосата и формальдегида) может отличаться. Выводы. Полученные нами результаты показывают, что исследуемый технический продукт глифосата кислоты при пероральном поступлении в организм млекопитающих в высоких дозах может проявлять слабую мутагенную активность, и свидетельствуют о необходимости оценки генотоксичности всех поступающих в Российскую Федерацию пестицидов-аналогов.

N A Ilyushinaa

Federal Scientific Center of Hygiene named after F. F. Erisman

G V Masaltsev

Federal Scientific Center of Hygiene named after F. F. Erisman

N S Averianova

Federal Scientific Center of Hygiene named after F. F. Erisman

  1. МР 4.2.0014-10. Оценка генотоксических свойств методом ДНК-комет in vitro. Методические рекомендации. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011. - 16с.
  2. СанПиН 1.2.2584-10. Гигиенические требования к безопасности процессов испытаний, хранения, перевозки, реализации, применения, обезвреживания и утилизации пестицидов и агрохимикатов. Санитарные правила и нормативы. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 2010. - 71с.
  3. Comparison of the in vivo and in vitro genotoxicity of glyphosate isopropylamine salt in three different organisms / C. Alvares-Moya [и др.] // Genetics and molecular biology. - 2014. - 37(1). - С. 105-110.
  4. Genotoxic activity of glyphosate and its technical formulation Roundup / С. Bolognesi [и др.] // Journal of agricultural and food chemistry. - 1997. - 45(5). - С. 1975-1962.
  5. Genotoxicity of glyphosate assessed by the comet assay and cytogenetic tests / F. Manas // Environmental ttoxicology and pharmacology. - 2009. - 28(1). - С. 37-41.
  6. IARC Monographs Volume 112. Evaluation of five organophosphate insecticides and herbicides. International Agency for Research on Cancer, World Health Organization, 2015. - 2 с.
  7. Li, A. P. An evaluation of the genotoxic potential of glyphosate / A. P. Li,T. J. Long // Fundamental and applied toxicology. - 1988. - 10 (3). - C. 537-546.
  8. Lovell D. P. Issues related to the experimental design and subsequent statistical analysis of in vivo and in vitro comet studies / D. P. Lovell, G. Thomas, R. Dubow // Teratogenesis, carcinogenesis, and mutagenesis. - 1999. - 19(2). - C. 109-19.
  9. Mladinic N. Characterization of chromatin instabilities induced by glyphosate, terbuthilazine and carbofuran using cytome FICH assay / N. Mladinic, P. Perkovic, D. Zeljezic // Toxicology letters. - 2009. - 189 (2). - С. 130-137
  10. OECD № 489. In vivo mammalian alkaline comet assay. Guideline. Organization of economic cooperation and development, 2014. - 27 с.
  11. The Pesticide Manual/ под ред. C D S Tomlin. - 5-е изд. - Hampshire, UK: British Crop Production Council, 2009. - 1457 c.
  12. Recommendations on the statistical analysis of the Comet assay / J. Bright [и др.] // Pharmaceutical statistics. - 2011. - 10(6). - С. 485-493.

Views

Abstract - 0

PDF (Russian) - 2

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies