APPLYING ENZYME IMMUNOASSAY IN THE LABORATORY AT THE CONTROL OF MYCOTOXIN S

Abstract

The article deals with the problem of contamination of food raw materials and food producers toxigenic microscopic fungi - Mycotoxins, and by enzyme immunoassay for their detection and quantitation in the laboratory of sanitary and epidemiological surveillance.

Full Text

Актуальность. Одно из ведущих мест в ряду приоритетных загрязнителей продовольственного сырья и пищевых продуктов принадлежит микотоксинам. Микотоксины (от греческого «mykes» - гриб и «toxicon» - яд) - это вторичные метаболиты микроскопических грибов (плесеней), обладающие выраженными токсическими свойствами. Все микотоксины отличаются высокой токсичностью, а многие из них обладают мутагенными, тератогенными и канцерогенными свойствами. В настоящее время известно около 250 видов различных микроскопических грибов, продуцирующих более 100 токсичных метаболитов. Продуцентами афлатоксинов и охратоксинов являются грибы рода Aspergillus, трихотоценовых микотоксинов: зеараленона, дезоксиниваленола и Т-2 токсина - Fusarium, патулина и охратоксинов- Penicillium. Следует иметь ввиду, что продуценты микотоксинов поражают пищевое сырье и продукты как растительного, так и животного происхождения на любом этапе их производства, хранения и в домашних условиях. Микотоксины могут попадать в организм человека и через систему пищевых цепей - с молоком и тканями животных, потреблявших загрязненный микотоксинами корм. Материал и методы исследования. Современные методы обнаружения и определения содержания микотоксинов в пищевых продуктах и кормах включают: • скрининговые методы, отличающиеся быстротой и простотой проведения анализов - микроколоночный, флуоресцентный и тонкослойная хроматография (ТСХ), • количественные аналитические химические методы (тонкослойная (ТСХ), газовая (ГХ) или газожидкостная (ГЖХ), высокоэффективная жидкостная хроматографии (ВЭЖХ) и масс-спектрометрия), • биологические методы, применяющиеся для микотоксинов, для которых отсутствуют химические методы анализа, или в качестве подтверждающих тестов - иммуноферментный анализ (ИФА). В России наибольшее распространение для анализа микотоксинов получили методы ТСХ, реже ГЖХ и ВЭЖХ, поскольку последние являются более длительными, требуют реактивов высокой степени чистоты. Результаты и их обсуждение: В ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Воронежской области» апробированы и внедрены в практику работы методики иммуноферментного анализа микотоксинов, которые используются в качестве арбитражного метода при обнаружении микотоксинов в пробах продуктов для подтверждения их наличия и количественной оценки. Метод ИФА относится к группе иммунохимических биохимических методов. Метод основан на специфическом взаимодействии антитела (АТ) с антигеном (АГ). В разных вариантах постановки метода АТ или АГ помечается так называемой ферментной меткой активности, представляющей собой очищенный фермент высокой активности, присоединенный посредством физико-химического взаимодействия к молекуле АТ или АГ. Фермент используется для визуализации иммунного взаимодействия. На последнем этапе постановки реакции добавляется субстрат, на который воздействует фермент с образованием специфического продукта. Принципиальным условием метода является отделение образующегося иммунного комплекса от других составляющих реакционной среды, что достигается, как правило, адсорбцией одного из специфических компонентов реакции на каком-либо носителе (стрипе). Затем посредством отмывания от мешающих компонентов в реакционной среде остается только искомый иммунный комплекс с ферментной меткой, к которому добавляется субстрат. В процессе проведения исследования образуются окрашенные продукты реакции. Измеряется оптическая плотность в лунках планшета на фотометре (ридере) при 450 нм. Теоретически метод ИФА основывается на фундаментальном законе химии - законе действия масс, что применительно к ИФА звучит так: «Количество меченого антигена, связавшегося с антителами, будет обратно пропорционально количеству определяемого антигена». В ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Воронежской области» апробированы и внедрены в практику работы методики иммуноферментного анализа микотоксинов, основанные на применении тестовых систем «RIDASCREEN» (Aflatoxin B1 30/15) и «RIDASCREEN FAST» (Aflatoxin M1,Ochratoxin A, Zearalenon, DON, T-2 Toxin) с комплектом необходимых реагентов. Принцип работы данных тест-систем основан на методе прямого конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе теста - взаимодействие антигенов с антителами. Лунки стрипов микротитровального планшета покрыты антителами захвата, связывающимися с анти-микотоксиновыми антителами. В лунки добавляются стандартные или исследуемые растворы, а также конъюгат микотоксина с ферментом и анти-микотоксиновые антитела. Свободный микотоксин и конъюгат микотоксина с ферментом конкурируют за центы связывания антител. Одновременно анти-микотоксиновые антитела связываются с неподвижными антителами захвата. Несвязанный ферментный конъюгат удаляется в процессе промывки. Далее в лунки планшета добавляется субстрат/хромоген. Связавшийся ферментный конъюгат преобразует хромоген в вещество голубого цвета. Добавление стоп-реагента приводит к изменению окраски лунок с голубого на желтый цвет. Измерение оптической плотности производится фотометрически при 450 нм. По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим значениям концентрации микотоксинов в мкг/кг (ppb) строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе. Концентрация микотоксинов в исследуемых пробах в мкг/кг (ppb) считывается по калибровочной кривой соответственно по относительному поглощению, измеренному и вычисленному для них. Для компьютерной обработки результатов измерений используется специализированное программное обеспечение РИДА(R) Софт. При компьютерной обработке результатов получаем визуализацию калибровочной кривой, данные для ее построения и рассчитанное значение определения конкретного микотоксина. Выводы. Метод ИФА можно считать экспресс-методом, так как его продолжительность для нескольких проб (до 42) не превышает 1,5 часа в отличие от длительных исследований методами ТСХ, ГЖХ и ВЭЖХ для одной пробы. Метод относительно экологичен, поскольку исключает большое количество токсичных реагентов. ИФА был дает хорошие результаты при использовании в качестве подтверждающего и арбитражного метода при количественном определении микотоксинов при их обнаружении в пищевых продуктах, а также при решении задач по определению микотоксинов в рамках инспекционных надзоров, при аккредитации лабораторий и межлабораторных сравнительных испытаниях (МСИ). Недостатком метода ИФА при контроле микотоксинов является высокая стоимость единичных исследований, обусловленная использованием тест-систем импортного производства. Использование метода ИФА целесообразно при одновременном исследовании большого количества проб в условиях поточности, поэтому метод может быть рекомендован при производственном контроле сырья и выпускаемой продукции. Метод ИФА для определения микотоксинов позволяет исследовать достаточно большое количество образцов сырья и готовой продукции, способен обеспечить приемлемую точность и быстроту при сравнительно низкой стоимости оборудования, применим для значительного количества показателей безопасности пищевых продуктов, и может быть рекомендован для внедрения в филиалы в районы области.