INFRADIAN RHYTHMS OF CORTISOL, LYMPHOCYTE SUBPOPULATION COMPOSITION AND CYTOKINE PRODUCTION WHOLE BLOOD CELLS IN MEN ADULTHOOD

Full Text

Актуальность. Применение хронобиологического подхода, учитывающего суточные ритмы функциональной активности нервной, иммунной, эндокринной и других систем человека, позволяет более эффективно проводить диагностику и терапию различных заболеваний [4]. Однако в последние годы внимание исследователей все чаше стало привлекать изучение многодневных (инфрадианных) ритмов физиологических параметров как экспериментальных животных, так и человека. Немногочисленные исследования многодневной динамики уровня стероидных гормонов указывают на существование около 4-х суточного ритма [2, 3, 5, 9]. Известно, что глюкокортикоидные гормоны оказывают системные эффекты, в том числе они модулируют функциональное состояние иммунной системы [6]. Методика функциональной оценки иммунной системы с помощью митогенной стимуляции продукции цитокинов в образце цельной или разбавленной культуральной средой крови получила широкое распространение [8]. Митоген-индуцированная стимуляция клеток крови позволяет оценить их потенциальную способность к секреции цитокинов. Однако, инфрадианный ритм уровня глюкокортикоидных гормонов может в значительной степени влиять на показатели этого теста. Таким образом, целью работы было исследование в группе мужчин зрелого возраста инфрадианных колебаний уровня кортизола, субпопуляционного состава лимфоцитов и продукции цитокинов клетками цельной крови, активированными смесью митогенов. Материалы и методы. В исследовании участвовали 7 мужчин 24-30 лет, соблюдавших режим сна с 22.30 по 7.00ч и не подвергавшихся дисстрессу в период проведения исследования. Забор крови проводился ежедневно с 29 сентября по 16 октября в 8 ч утра по местному солнечному времени. Для оценки способности клеток к синтезу цитокинов после митогенной стимуляции использовали коммерческий набор «Цитокин-Стимул-Бест» производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Кровь с ЭДТА разбавляли в 5 раз стерильной поддерживающей средой DMEM содержащей гепарин (2,5 ЕД/мл), гентамицин (100 мкг/мл) и L-глютамин (0,6 мг/мл). Смесь митогенов, содержащую ФГА-М, ФГА-П, Кон-А и ЛПС в соотношении 2:2:2:1, добавляли в исследуемый образец разбавленной крови в конечной суммарной концентрации - 14 мкг/мл. Затем в течение суток образец инкубировали при 37 ºС в СО2 инкубаторе. Образцы сывороток и супернатант хранили не более месяца при температуре -40 ºС. Уровень кортизола в сыворотке крови определяли ИФА наборами «DRG» (Германия). Концентрацию интерферона γ (ИФН-γ), интерлейкина-2 (ИЛ-2), -10 в супернатанте определяли методом ИФА, наборы «Bender MedSystems» (Австрия). Уровень рецепторного антагониста ИЛ-1 (ИЛ-1РА) в сыворотке крови определялся методом ИФА «Biosource» (Бельгия). Для регистрации результата использовали микропланшетный ИФА анализатор «ANTHOS 2020» (Австрия). Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови определяли с помощью проточного цитофлюориметра Cytomics FC500 «BeckmanCоulter» (США), с использованием 4-х цветных меток. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы “Statistica 6.0”. В соответствии с характером распределения был выбран непараметрический метод. Достоверность различий между показателями определяли по U-критерию Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Результаты. В динамике уровня кортизола у здоровых мужчин наблюдались синхронные у разных индивидов 4-сут колебания (Таблица). Показатели в акрофазе и батифазе достоверно различались. Динамика уровня ИЛ-1РА в сыворотке крови коррелировала с уровнем кортизола (коэффициент корреляции r = 0,71) и имела достоверную 4-х сут периодичность. У отдельных испытуемых колебания этого показателя составляло по амплитуде до 50%. ИЛ-1РА, присутствующий в циркуляторном русле, блокирует действие ИЛ-1 и препятствует активации каскада провоспалительных реакций. Изменение уровня ИЛ-1РА в периферической крови, является одним из важных факторов, от которых зависят триггерные механизмы воспалительного процесса. По литературным данным физиологический стресс, вызывающий повышение уровня кортизола, приводит и к повышению ИЛ-1РА в сыворотке крови у человека [12]. По данным цитофлюориметрического исследования индекс Т-хелперы/Т-супрессорно-цитотоксические лимфоциты (Тх/Тс-ц) также имел 4-х сут периодичность и находился в противофазе к уровню кортизола (r= - 0,65). Процентное содержание НК-клеток в периферической крови группы доноров имело четкую 4-х сут периодичность, совпадающую по фазе с уровнем кортизола (r=0,89). В динамике уровня продукции ИФН-γ клетками крови, активированными смесью митогенов, наблюдались синхронные у разных индивидов 4-х сут ритмические изменения. Концентрации ИФН-γ в супернатантах суточных культур отличались в разы между днями с максимальным и минимальным уровнем продукции и отрицательно коррелировала с уровнем кортизола в сыворотке крови (r = - 0,58). Продукция ИЛ-2 активированными клетками крови положительно коррелировала с уровнем продукции ИФН-γ (r = 0,63) и отрицательно коррелировала с уровнем кортизола (r = - 0,63). Уровень продукции противо-воспалительного ИЛ-10 имел также 4 сут периодичность. Дни максимальной продукции ИЛ-10 совпадали с максимальным уровнем кортизола в сыворотке крови (r = 0,62). По литературным данным кортизол угнетает продукцию провоспалительных цитокинов [7, 13], что согласуется с полученными результатами оценки уровня цитокинов: наблюдалась обратная зависимость между уровнями кортизола и продукции ИФН-γ и ИЛ-2 в образцах крови и прямая зависимость между уровнями кортизола и продукции ИЛ-10. Таким образом, соотношение провоспалительные/противовоспалительные цитокины значительно изменялось в зависимости от дня исследования. Таблица 1 Динамика показателей уровня кортизола, ИЛ-1РА, индекса Тх/Тс-ц и НК-клеток в периферической крови, а также продукции ИЛ-2, ИФН-γ и ИЛ-10 клетками цельной крови индуцированными смесью митогенов. Результаты представлены в процентах от индивидуальных средних значений. Дата Кортизол %, Ме±CI Тх/Тс-ц %, Ме±CI НК-клетки %, Ме±CI ИЛ-1РА %, Ме±CI ИЛ-2 %, Ме±CI ИФН-γ %, Ме±CI ИЛ-10 %, Ме±CI 29.09.10 30.09.10 01.10.10 02.10.10 03.10.10 04.10.10 05.10.10 06.10.10 07.10.10 08.10.10 09.10.10 10.10.10 11.10.10 12.10.10 13.10.10 14.10.10 15.10.10 16.10.10 100±10 113±12 87±9 91±13 112±15 111±7 82±18 85±11 113±6 112±8 79±10 88±8 100±13 103±17 97±9 86±4 114±8 115±15 98±9 87±16 97±12 112±7 109±4 94±8 118±16 125±12 79±5 84±6 114±15 100±8 91±11 94±12 107±7 120±4 111±12 96±6 97±8 118±12 95±11 85±6 118±9 109±13 93±7 86±10 108±7 115±12 84±13 91±6 105±18 120±13 90±5 83±7 114±19 118±8 87±13 108±8 84±14 96±9 118±6 116±9 97±5 114±8 119±11 121±7 85±12 78±9 102±14 112±9 94±7 104±15 122±10 110±7 56±18 54±16 134±21 146±33 102±43 52±22 118±16 153±36 105±30 93±14 88±13 163±44 65±9 48±16 132±14 117±38 61±9 58±17 18±7 22±5 75±46 79±21 83±61 24±5 191±24 242±87 111±64 109±7 68±18 180±47 70±59 45±25 177±51 204±123 51±2 47±6 137±8 139±7 96±24 67±11 86±64 153±19 113±13 83±9 74±12 94±11 38±9 46±7 79±15 151±5 78±16 60±18 158±20 156±16 Повышение уровня глюкокортикоидных гормонов и числа лейкоцитов в периферической крови связывают со стрессорными воздействиями, в том числе и геомагнитными бурями [11]. В нашем исследовании 4 сут колебания уровня кортизола и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови наблюдалось по данным ИЗМИРАН на фоне спокойной геомагнитной обстановки. Выводы. Таким образом, выявленые ритмические изменения уровня кортизола влияет на иммунологические показатели в частности: на концентрацию ИЛ-1РА, индекс Тх/Тц, содержание НК-клеток в периферической крови. В группе испытуемых эти колебания составляли 4 суток и были синхронны у разных индивидов, что делает возможным, при дальнейшем исследовании, делать прогноз таких изменений. Данное исследование показывает, что продукция цитокинов индуцированная смесью митогенов в образце периферической крови, разведенной поддерживающей средой в 5 раз, зависит от уровня кортизола и субпопуляционного состава лимфоцитов в исследуемом образце, что обуславливает значительные изменения в балансе провоспалительные/противовоспалительные цитокины, являющемся важным для функциональной оценки активности иммунной системы. Факт изменения уровня продукции ИФН-γ при инкубации образца крови с митогеном в зависимости от даты исследования, необходимо учитывать, в частности, при проведении диагностических тестов основанных на продукции этого цитокина в ответ на специфический антиген [1, 10]. Можно предположить, что в определенные дни с низким содержанием кортизола в сыворотке крови чувствительность таких тестов увеличивается, а в другие: с высоким уровнем сывороточного кортизола - снижается. Таким образом, инфрадианный ритм изменения продукции цитокинов необходимо учитывать при проведении лабораторных иммунологических и диагностических исследований, основанных на индукции синтеза цитокинов в образцах цельной или разведенной крови. Выявленные временные закономерности изменения уровня кортизола и изученных иммунологических параметров следует учитывать при оценке иммунного статуса здоровых лиц и разработке методов коррекции его нарушений.

About the authors

ME E Diatroptov

Institute of Human Morphology

References