DIASTOLIC DYSFUNCTION AS A RESULT OF REVERSE NA + / CA2 + EXCHANGE IN CASE OF "CALCIUM PARADOX" IN THE HEART MUSCLE

Full Text

Актуальность. Одной из особенностей функционирования сердечной мышцы является зависимость ее метаболизма и сократительной функции от внутриклеточной концентрации Са2+. В покое концентрация Са2+ в цитоплазме колеблется от 10-7 моль/л до 10-6 моль/л. В период систолы, когда требуется повышенная концентрация Са2+, его уровень может увеличиваться не более чем до 10-5 моль/л. В норме, такие циклические повышения уровня Са2+ являются физиологическими. Однако, при некоторых патологических условиях, прежде всего ишемии и последующей реперфузии коронарных сосудов концентрация Са2+ в цитоплазме может достигать опасных для клеток сердца величин. Увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция выше нормы приводит к формированию синдрома, получившего название «оглушённого миокарда». Кальциевый компонент этого вида повреждения кардиомиоцитов в условиях эксперимента можно воспроизвести в виде «кальциевого парадокса», в результате которого иногда развивается необратимая контрактура миокарда. Данный вид патологии сердца моделируют путем реперфузии сердца Са2+-содержащим раствором после непродолжительной перфузии бескальциевой средой. Повреждение клеток происходит только во время реперфузии сердца раствором, имеющего физиологическую концентрацию Са2+ [7]. Данный прием моделирования кальциевой перегрузки сердца получил название "кальциевый парадокс". Следует заметить, что механизм повреждения сердца при данной ситуации до конца не изучен. Центральным вопросом патогенеза развития этой патологии является механизм развития полной асистолии миокарда, которая является следствием «кальциевого парадокса». Мнения ученых по этому поводу разноречивы. Одни авторы рассматривают прямое участие в этом процессе механизма Nа+/Са2+ обмена [5]. Другие считают, что контрактура вызывает локальные повреждения сарколеммы, в результате чего наблюдается попадание избытка ионов кальция внутрь кардиомиоцитов через разрывы клеточной мембраны [9]. Это суждение становится тем более актуальным, поскольку в ряде научных исследований обнаружены в зоне ишемии сердца значительные нарушения распределения уровня Nа+ вне- и внутри клеток [4, 11]. Предполагают, что в этих условиях может активно вовлекаться система Nа+/Са2+ обмена, которая может являться главной причиной значительного увеличения внутриклеточного уровня Са2+ [2]. Совершенно очевидно, что от правильного решения этой проблемы зависит тактика применения лекарственных средств, которые смогли бы ослабить явления, сходные с механизмом развития «кальциевого парадокса» у больных с заболеваниями сердца. В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение причин развития асистолии миокарда при кальциевом парадоксе и установлении зависимости ее развития от активности системы Nа+/Са2+ обмена. Материал и методы исследования. Эксперименты проводились на изолированных сердцах белых крыс, перфузированных по методу Лангендорфа оксигенированным (t=37̊С̊ раствором Рингера-Локка, содержащим (мМ): NaCI-140, NаН2РО4 -0,5; КСl-5,0; трис-НСl-буфер, (рН= 7,4)- 5;СаСl2 -2; глюкозу-11. Под эфирным наркозом крыс декапитировали, вскрывали грудную клетку и сердце помещали в охлажденный раствор Рингера-Локка. В аорту вводили канюлю и со скоростью 10 мл/мин подавали исходный раствор в течение 15 минут для стабилизации сократительной функции и показателей энергетического состояния. Феномен «кальциевого парадокса» создавали путем перфузии сердца бескальциевой средой, содержащей 0,5 мМ ЭДТА в течение 10 минут. Затем сердце продолжали перфузию раствором, в котором концентрация кальция возвращалась к исходному уровню - 2,0 мМ. В результате возникало реперфузионное повреждение миокарда - «кальциевый парадокс». Для оценки роли Nа+/Са2+ обмена в интенсивности развития «кальциевого парадокса», изменяли концентрацию NаСl в растворе, не содержащим кальций. Активацию или ослабление Nа+/Са2+ обмена осуществляли путем уменьшения или увеличения уровня NaCI в бескальциевом перфузионном растворе. Показано, что снижение концентрации Nа+ во внеклеточном пространстве способствует его выходу из клеток в обмен на внеклеточный Са2+ [3]. В условиях повышения внеклеточного уровня Nа+ возникает обратный процесс - поступление внутрь клеток натрия в обмен на внутриклеточный Са2+ [1]. В опытах, когда повышали концентрация хлорида натрия до 200 мМ, в контрольной серии осмотическое давление внеклеточной среды увеличивали путем добавления 120 мМ сахарозы. При снижении концентрации хлорида натрия недостаток осмотического давления компенсировали, добавляя в необходимом количестве сахарозу. Для оценки глубины повреждения миокарда были использованы следующие показатели: диастолическое давление в левом желудочке, выход миоглобина в оттекающий перфузионный раствор, концентрация в ткани АТФ и фосфокреатина, сопряжение процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях. Сократительную активность миокарда изучали в изоволюмическом режиме с помощью латексного баллончика, введенного в полость левого желудочка. В работе был использован электроманометр фирмы "Bentley lab. Europe" и электронный потенциометр Н3030-4 (СНГ). Контрактуру миокарда определяли как стойкое увеличение диастолического давления выше исходного более чем на 2 мм. рт. ст. без развития сокращений. Через 15 минут реперфузии сердца исходным раствором сердца замораживали при температуре жидкого азота с помощью щипцов Волленбергера и готовили тканевые экстракты в 6%-ной трихлоруксусной кислоте. После центрифугирования при 3000 g супернатант нейтрализовали 2N раствором КОН при температуре 0 - 5̊С. Содержание креатина оценивали спектрофотометрически с помощью альфа-нафтола. После предварительного гидролиза проб в 0,1N растворе НСl и определяли содержание суммарного креатина (креатин +фосфокреатин). Концентрацию фосфокреатина вычисляли по разности содержания в ткани креатина и тотального креатина [8]. Содержание адениннуклеотидов определяли стандартными ферментативными методами [6]. В отдельной группе экспериментов содержание миоглобина в оттекающем перфузионном растворе оценивали спектрофотометрически непрерывно с помощью проточной кюветы при 410 нм. Митохондрии сердца получали после гомогенизирования ткани сердца методом дифференциального центрифугирования [5]. Сухую массу ткани определяли после предварительного высушивания образцов при 100̊С в течение 24 часов. Полученные данные обработаны методом вариационной статистики с использованием критерия t Стьюдента, анализа вариации ANOVA. Полученные результаты и их обсуждение. В первой серии опытов после стабилизации сокращений переводили перфузию сердца на раствор, в котором отсутствовал Са2+. При этом наблюдалась остановка сердца в диастоле. Реперфузия сердца Са2+ - содержащим раствором после 10 минут перфузии бескальциевой средой сопровождалась интенсивным выходом миоглобина в оттекающий от сердца перфузионный раствор (рис.1). Рис.1. Влияние концентрации Na+ в бескальциевой среде на выход миоглобина из сердца при «кальциевом парадоксе». 1--[Na+] = 140 mM; 2- [Na+] = 80 mM; 3- [Na+] = 30 mM; 4- [Na+] = 200 mM; В митохондриях наблюдалось уменьшение величины дыхательного контроля, скорости фосфорилирующего дыхания (табл.1). Одновременно более чем на 90% по сравнению с исходным состоянием уменьшалась внутриклеточная концентрация АТФ и фосфокреатина (табл.2). В сердце развивалась реперфузионная контрактура миофибрилл. Таблица 1. Влияние состава бескальциевой среды на параметры дыхания митохондрий сердца при “кальциевом парадоксе”. Параметры опыта Показатель дыхания изолированных митохондрий V0, натом/сек на 1 мг белка V3, натом/сек на 1 мг белка V4, натом/сек на 1 мг белка Дыхательный контроль по Ларди Дыхательный контроль (по Б. Чансу) АДФ/t, мкмоль/сек на 1 мг белка АДФ/О Субстрат окисления- глутамат и малат (по 5 мМ) Исходное состояние 0,267±0,020 1,866±0,106 0,209±0,015 7,26±0,40 8,94±0,56 5,68±0,29 2,94±0,13 “Кальциевый парадокс” [Na+]=140 mM (контроль) 0,22±0,012* 0,35±0,04** 0,25±0,015** 1,59±0,24*** 1,47±0,23** 0,61±0,05*** 2,45±0,23 [Na+]=30 mM 0,192±0,006 0,198±0,007 - 1,039±0,05 - - - [Na+]=80 mM 0,143±0,005 0,144±0,033 - 1,017±0,003 - - - [Na+]=200 mM 0,328±0,029 2,417±0,122 0,436±0,063 7,927±0,783 5,767±0,825 3,296±0,304 2,460±0,275 Субстрат окисления- - глутарат (10 мМ) Исходное состояние 0,252±0,004 0,903±0,030 0,169±0,007 3,590±0,01 5,485±0,315 2,240±0,055 2,740±0,070 “Кальциевый парадокс” [Na+]=140 mM (контроль) 0,185±0,008 0,261±0,012 0,207±0,010 1,434±0,090 1,276±0,060 0,865±0,088 2,852±0,159 [Na+]=30 mM 0,106±0,005 0,106±0,005 - 1,007±0,005 - - - [Na+]=80 mM 0,132±0,005 0,143±0,004 - 1,090± 0,030 - - - [Na+]=200 mM 0,540±0,006 1,284±0,009 0,477±0,003 2,382±0,034 2,700±0,030 2,990±0,030 3,490±0,110 Таблица 2. Влияние состава бескальциевой среды на содержание в сердце адениннуклеотидов, креатина и фосфокреатина при “кальциевом парадоксе”, мкмоль/г сухой массы. Параметры опыта АТФ АДФ АМФ Креатин Фосфокреатин Исходное состояние 23,87±0,43*** 8,35±0,54** 1,13±0,10 51,82±0,86*** 33,57±1,70*** [Na+] = 140 mM; (контроль) 4,94±0,18 3,34±0,14 2,95±0,19 39,17±2,44 0,73±0,08 [Na+] = 30 mM 0±0*** 2,45±0,13 2,11±0,17 17,46±0,58*** 0±0*** [Na+] = 80 mM 0±0*** 2,56±0,08 2,57±0,14 17,44±0,69*** 0±0*** [Na+] = 200 mM 12,55±0,23*** 2,49±0,14 1,41±0,14 69,41±2,13*** 8,71±0,51** [Na+] = 140 mM, сахароза 120 мМ 5,04±0,24 3,27±0,14 3,06±0,32 38,66±2,42 0,79±0,15 Примечание: Представлены данные 5-14 экспериментов в серии. Обозначены достовеpные отличия для p<0,05- одной звездочкой, для р<0,01- двумя звездочками, для р<0,001- тремя звездочками по сpавнению с контpолем (Na+=140 mM) В следующих экспериментах реперфузию сердца осуществляли после 10 минутной перфузии сердца бескальциевой средой с уменьшенной концентрацией NаСI (30 мM и 80 мM). Осмотическое давление раствора сохраняли путем добавлением сахарозы. Во время перфузии бескальциевым раствором с низкой концентрацией натрия сердце также останавливалось в диастоле. Реперфузия сердца обычным перфузионным раствором сопровождалась более значительным выходом миоглобина из сердца (более чем в 4-5 раз) по сравнению с экспериментами, в которых бескальциевая среда содержала физиологическую концентрацию хлорида натрия (рис.1). Одновременно отмечалось полное разобщение процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях, уменьшение до нуля концентрации АТФ и фосфокреатина в сердце (табл.1,2). Несмотря на значительное разрушение кардиомиоцитов, контрактура в этих опытах при реперфузии не возникала. Сердце продолжало оставаться в расслабленном состоянии - диастоле (рис.2). Рис. 2. Влияние концентрации Na+ в бескальциевой среде на величину контрактуры миокарда при «кальциевом парадоксе». 1 - [Na+] = 140 mM; 2 - [Na+] = 80 mM; 3 - [Na+]=30 mM; 4- [Na+] = 200 mM В следующих сериях опытов изучали влияние бескальциевой среды с увеличенным уровнем NаCl (200 мM) в растворе. После удаления кальция наблюдалась остановка сердца в диастоле. Реперфузия сердца физиологическим раствором в отличие от предыдущих опытов характеризовалась значительно меньшим выходом миоглобина из сердца. В этих экспериментах наблюдалось более полное сохранение концентрации АТФ и фосфокреатина, снижалась степень разобщения процессов окисления и фосфорилировния в митохондриях (табл.1,2; рис.1). При реперфузии сердца после 10 минутного воздействия гипернатриевой бескальциевой средой наблюдалась менее выраженная контрактура миокарда. По сравнением с контрольными опытами величина контрактуры была на 20% меньше (рис.2). Таким образом, высокая внеклеточная концентрация натрия в бескальциевом растворе значительно ослабляла нарушения биохимических процессов, уменьшала степень нарастания контрактуры миофибрилл. Сравнивая результаты проведенных опытов можно отметить, что при физиологической концентрации ионов натрия в бескальциевом растворе (140 мМ, контроль) повреждение миокарда при реперфузии Са2+-содержащим раствором сопровождалось развитием контрактуры миокарда. Высокая внеклеточная концентрация ионов натрия (200 мM) значительно ослабляла нарушения биохимических процессов, однако не препятствовала развитию контрактуры сердца. Самые значительные нарушения биохимических процессов происходили при использовании бескальциевых растворов, имеющих низкий уровень ионов натрия (30 мM или 80 мM). Однако контрактура миокарда при реперфузии Са-содержащим раствором в этих опытах не возникала. Выводы. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об отсутствии корреляции между глубиной повреждения сердца и развитием контрактуры миофибрилл сердца. Данные наблюдения не подтверждают мнение о том, что контрактура миофибрилл является главной причиной повреждения кардиомиоцитов при кальциевом парадоксе, т.е. причиной разрушения кардиомиоцитов при развитии кальциевого парадокса не могут служить механические повреждения, вызванные контрактурой миокарда. Продемонстрированное рядом авторов снижение внеклеточного уровня натрия и увеличение его внутриклеточной концентрации при нарушении коронарного кровообращении может обуславливать усиление реверсного направления поступления Са2+ внутрь клеток [10, 11]. Как показали наши результаты исследований, активация этого процесса, создавая избыток Са2+ в миоплазме, способна повреждать сарколемму и миофибриллярные белки. В опытах наблюдалось полное исчерпание запасов макроэргических веществ. Отсутствие АТФ, а также дезинтеграция миофибриллярных белков стали причиной отсутствия реакции миокарда на Са2+ при реперфузии Са2+-содержащим раствором. Резкие нарушения энергетического обеспечения митохондриями сопровождались активизацией гликолиза. Известно что внутриклеточный лактат-ацидоз, продуцируя избыток протонов, может нарушать связывание тропонина-С с ионами Са2+. Это могло служить еще одной причиной отсутствия реакции сократительного аппарата сердца на избыток внутриклеточного Са2+, поступающего в кардиомиоциты при реперфузия сердца средой, имеющей физиологические концентрация Nа+ и Са2+. Повышая внеклеточную концентрацию Nа+ в перфузионном растворе удавалось значительно уменьшить метаболические нарушения и частично ослабить повреждения сократительных структур в сердце. Это говорит о том, что замедляя реверсный путь Nа+/Са2+ обмена можно снизить повреждения в условиях кальциевой перегрузки миокарда. Исходя из данных выводов, профилактикой развития «кальциевого парадокса», сопровождающегося повреждением миофибрилл могут служить такие лекарственные средства, которые способны ослаблять поток ионов Са2+ при реверсии Nа+/Са2+ обмена.

About the authors

AA A Vinokurov

Voronezh State Medical Academy

VV V Alabovsky

Voronezh State Medical Academy

VV V Hamburov

Voronezh State Medical Academy

OV V Maslov

Voronezh State Medical Academy

References