Functional activity of cardiac mast cells as a trigger factor for variability of clinical and laboratory parameters in patients with COVID-19

Ekaterina Dmitrievna Arkhipova; Архипова Екатерина Дмитриевна; Andrey Valerievich Budnevsky; Будневский Андрей Валериевич; Victoria Victorovna Shishkina; Шишкина Виктория Викторовна; Tatyana Alexandrovna Chernik; Черник Татьяна Александровна; Jaroslav Igorevich Kartashov; Карташов Ярослав Игоревич

doi:10.18499/1990-472X-2024-25-3-%p

Functional activity of cardiac mast cells as a trigger factor for variability of clinical and laboratory parameters in patients with COVID-19

Authors: Arkhipova E.D.¹, Budnevsky A.V.¹, Shishkina V.V.¹, Chernik T.A.¹, Kartashov J.I.¹
Affiliations:
1. Burdenko VSMU of the Ministry of Health of the Russian Federation
Issue: Vol 25, No 4 (2024): ОПУБЛИКОВАН 27.12.2024
Section: Внутренние болезни
URL: https://new.vestnik-surgery.com/index.php/1990-472X/article/view/10188
DOI: https://doi.org/10.18499/1990-472X-2024-25-3-%25p

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Statistics

Abstract

The purpose of the study was to evaluate the protease activity of mast cells (MC) of cardiac tissue in the new coronavirus infection (NCI) COVID-19, as well as to analyze their correlations with clinical and laboratory parameters.

Materials and methods. The formed sample consisted of 40 patients (21 men (52.5%), 19 women (47.5%), mean age 66.65 ± 7.40 years) with a severe or extremely severe COVID-19. The examination of patients included a clinical assessment of their condition, chest computed tomography, complete blood count, coagulation testing, as well as determination of the level of procalcitonin and potassium in the blood. Clinical and laboratory parameters were assessed on the first day of hospitalization and on the eve of death. During immunohistochemical analysis, quantitative assessment of tryptase-, chymase-, and carboxypeptidase A3 (CPA3) positive MCs was performed to determine their secretory activity.

Results and conclusion. The largest number of MCs in the heart tissues were tryptase-positive, most of which had signs of degranulation. Correlation analysis revealed a number of relationships between the number of MCs of individual phenotypes and some markers of inflammation, hypoxia, and electrolyte disturbances. The presented data indicate a variety of mechanisms of cardiac MC involvement in the systemic pathological process in NCI. In addition, the study results contain evidence of the effectiveness of therapy with dexamethasone, unfractionated heparin, and IL-6 inhibitors in this cohort of patients, due to stabilization of MCs and suppression of their degranulation activity.

Keywords

mast cells, COVID-19, mast cell protease activity, chymase, tryptase, carboxypeptidase A3.

Full Text

Актуальность. Тучные клетки (ТК) являются высокогетерогенным многофункциональным клеточным компонентом соединительной ткани, имеющим миелоидное происхождение, с характерным пограничным положением, обеспечивающим контакт с окружающей средой: кожа, дыхательная, пищеварительная и другие системы [1, 2]. Это обусловлено, в том числе, их вовлеченностью в иммунные процессы. Наравне с этим ТК участвуют во множестве других физиологических процессов, таких как развитие органов, ангио- и лимфогенез, заживление ран и другие [3].

Ткани сердца отличаются относительно низким содержанием ТК. Однако их представительство в указанном органе связано с осуществлением ряда процессов. Известно, что ТК способны выделять ренин, а также химазу – протеазу, которая гидролизует ангиотензин I до ангиотензина II (АТ II), что способствует регуляции ренин-ангиотензиновой системы сердца, а также развитию гипертензии, окислительного стресса и, косвенно, возникновению нарушений ритма [4, 5]. ТК необходимы для осуществления адекватного сокращения и расслабления кардиомиоцитов, так как регулируют чувствительность миофиламентов к кальцию [6]. Кроме того, эти клетки участвуют в метаболизме липидов и развитии коронарных артерий [7].

Помимо физиологических процессов и участия в кардиопротективных механизмах, ТК являются компонентом и ряда патологических процессов в сердце. Так, инфильтрация тканей сердца ТК наблюдалась в модели сердечной недостаточности и фибрилляции предсердий [8, 9]. В моделях вирусного миокардита на мышах было показано усиление инфильтрации воспалительными клетками, некроза и снижение выживаемости у особей без дефицита ТК по сравнению с группой с дефицитом [10].

Известно о возможности поражения тканей сердца при новой коронавирусной инфекции (НКИ) COVID-19. Имеется ряд исследований, характеризующих миокардиты, перикардиты, ишемические повреждение, тромбоэмболии, а также нарушения ритма, возникшие вследствие НКИ [11]. Однако данные о ТК тканей сердца при данной патологии ограничены. Таким образом, вызывает интерес изучение кардиальных ТК у пациентов с новой коронавирусной инфекцией (НКИ) COVID-19.

Цель исследования – выполнить оценку протеазной активности тучных клеток тканей сердца при COVID-19, а также провести анализ их корреляционных связей с клиническими и лабораторными показателями.

Материал и методы исследования. Сформированная выборка состояла из 40 пациентов (21 мужчина (52,5%), 19 женщин (47,5%), средний возраст 66,65 ± 7,40 лет), проходивших стационарное лечение с диагнозом COVID-19 тяжелого и крайне тяжелого течения. Подтверждение диагноза производилось на основании временных методических рекомендаций «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)» с применением метода полимеразной цепной реакции. Клиническая характеристика исследованного контингента представлена в таблице 1.

Таблица 1 –Клиническая характеристика контингента

Показатель	Значения
Продолжительность НКИ до летального исхода (дни)	18,48 ± 8,58
Продолжительность госпитализации до летального исхода (дни)	12,0 ± 7,9
Двусторонняя пневмония (абс / %)	40 (100%)
Артериальная гипертензия(абс / %)	31 (77,5%)
Стабильная стенокардия напряжения (абс / %)	1 (2,5%)
Инфаркт миокарда в анамнезе (абс / %)	1 (2,5%)
Хроническая сердечная недостаточность	9 (22,5%)
I	5 (12,5%)
II А	4 (10,0%)
Острое нарушение мозгового кровообращения (абс / %)	5 (12,5%)
Острое нарушение мозгового кровообращения в анамнезе (абс / %)	3 (7,5%)
Ожирение(абс / %)	6 (15,0%)
I степень	3 (7,5%)
II степень	1 (2,5%)
III степень	2 (5,0%)
Хронический пиелонефрит (абс / %)	2 (5,0%)
Хроническая болезнь почек (абс / %)	4 (10,0%)
С1	2 (5,0%)
С2	2 (5,0%)

Критериями включения выступали наличие у пациента НКИ тяжелого или крайне тяжелого течения с последующим летальным исходом по причине острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС).

К критериям невключения относились хронические респираторные заболевания (хронический бронхит, хроническая обструктивная болезнь легких, бронхиальная астма и другие), инфекционные заболевания легких (за исключением COVID-19), тромбоэмболия легочной артерии, хроническая сердечная недостаточность тяжелее IIА стадии, сахарный диабет, хроническая болезнь почек тяжелее С2, гепатиты и цирроз печени, онкологические заболевания.

Обследование включенных пациентов состояло из клинической оценки их состояния, компьютерной томографии органов грудной клетки, общего анализа крови, коагулограммы, а также определения уровня прокальцитонина и калия крови. Клинические и лабораторные показатели оценивались в первый день госпитализации и накануне смерти.

Гистологическое исследование включало следующие этапы: фиксацию аутопсийного материала с использованием 10%-ого нейтрального забуференного формалина, заливку в парафин, нарезку образцов с толщиной 2 и 5 мкм для иммуногистохимического анализа и окрашивания гематоксилином и эозином, раствором Гимза, соответственно.

Для детекции триптазы, химазы и карбоксипептидазы А3 (CPA3) ТК были использованы первичные мышиные антитела (Anti-Mast Cell Tryptase antibody, клон AA1, #ab2378; разведение 1:4000, Anti-Mast Cell Chymase antibody, #ab233103 разведение 1:1000; кроличьи антитела Anti-CPA3, #ab251685; разведение 1:1000, соответственно). Контрастирование ядер осуществлялось докрашиванием гематоксилином Майера. После чего срезы помещались в монтажную среду. Проводилась количественная оценка триптаза-, химаза- и CPA3-позитивных ТК для определения их секреторной активности.

Использовался микроскоп Zeiss Axio Imager.А2 (Carl Zeiss, Германия) с системой фотодокументирования изображений и цифровой камерой Camera Axiocam 506 color (Carl Zeiss, Германия). Изображения были обработаны в программе ZEN 2.3. Для подсчета ТК был использован объектив × 40 с анализом ≥ 50 полей зрения. Учитывались общее число ТК и степень дегрануляции, а также их секреторная активность с оценкой протеазного профиля (триптаза, химаза, CPA3) на 1 мм2.

Статистическая обработка была проведена с использованием пакетов статистических программ. При нормальном распределении количественные данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. При распределении данных отличном от нормального – в виде медианы и межквартильного размаха. Категориальные данные представлены в виде абсолютного значения и процента. Был использован корреляционный анализ с определением коэффициента корреляции Спирмена. Статистически значимыми считались значения p <0,05.

Полученные результаты и их обсуждение. Протеазный профиль ТК сердца в изучаемых образцах представлен в таблице 2. Наибольшее количество ТК в тканях сердца было представлено триптаза-позитивным фенотипом, из которых большая часть имела признаки дегрануляции.

Таблица 2 – Протеазный профиль кардиальных тучных клеток в изучаемых образцах (n=40)

Показатель	Ткани сердца
Медианы триптаза-позитивных ТК на 1 мм2
ТК без признаков дегрануляции	0,00 [0, 00; 0, 17]
Дегранулированные ТК	2,22 [1, 71; 3, 165]
Всего	2,39 [1, 795; 3, 42]
Медианы химаза-позитивных ТК на 1 мм2
ТК без признаков дегрануляции	0,00 [0,00; 0,085]
Дегранулированные ТК	0,34 [0, 00; 0, 68]
Всего	0,34 [0, 00; 0, 85]
Медианы CPA3-позитивных ТК на 1 мм2
ТК без признаков дегрануляции	0,00 [0,00; 0,00]
Дегранулированные ТК	1,625 [1, 115; 3, 075]
Всего	1,2 [0, 51; 2, 135]

Корреляционный анализ позволил выявить ряд положительных связей между общим количеством триптаза-позитивных ТК, систолическим артериальным давлением (САД) (r=0,39; p=0,0159) и диастолическим артериальным давлением (ДАД) (r=0,34; p=0,0356) в первые сутки госпитализации, а также отрицательную связь с применением дексаметазона (r=-0,31; р= 0,0494).

Количество триптаза-позитивных ТК с признаками дегрануляции сформировало положительные корреляционные связи с САД (r=0,37; p=0,0214), ДАД (r=0,33; p=0,0410) в первые сутки госпитализации, а также отрицательную связь с калием накануне смерти (r=-0,75; p=0,0472).

Количество триптаза-позитивных ТК без признаков дегрануляции имело положительные корреляционные связи с количеством палочкоядерных нейтрофилов (r=0,74; p=0,0101), прокальцитонином (r=0,89; p=0,0114), в первый день госпитализации, количеством моноцитов накануне смерти (r=0,43; p=0,0113), а также отрицательные связи с возрастом пациентов (r=-0,41; p=0,0113) и наличием кашля (r=-0,32; р= 0,0469), в первый день госпитализации (r=-0,35; p=0,0410),

Общее количество химаза-позитивных ТК было положительно связано с количеством палочкоядерных нейтрофилов (r=0,71; p=0,0133), скоростью оседания эритроцитов (СОЭ) (r=0,33; p=0,0480), активированным частичным тромбопластиновым временем (АЧТВ) (r=0,39; р=0,0349) в первый день госпитализации, температурой тела накануне смерти (r=0,33; p= 0,0445), а также отрицательно связано с назначением нефракционированного гепарина (НФГ) (r= -0,42; р= 0,0089).

Количество химаза-позитивных ТК с признаками дегрануляции было положительно связано с количеством палочкоядерных нейтрофилов (r=0,67; p=0,0194), СОЭ (r=0,34; p=0,0434), АЧТВ (r=0,37; р=0,0437) в первый день госпитализации, температурой тела накануне смерти (r=0,36; p= 0,0275), а также отрицательно связано с назначением НФГ (r= -0,47; р= 0,0037).

Положительные корреляционные связи присутствовали между количеством химаза-позитивных ТК без признаков дегрануляции, количеством палочкоядерных нейтрофилов (r=0,57; p=0,0464) в первый день госпитализации. Отрицательные связи определялись с использованием в терапии ингибиторов интерлейкина 6 (ИЛ-6) (r=-0,33; р= 0,0371).

Также положительные корреляционные связи были обнаружены между общим количеством CPA3-позитивных ТК и возрастом пациентов (r=0,3789; p=0,0180) и количеством моноцитов накануне смерти (r=0,3968; p=0,0189).

Были определены положительные связи между количеством CPA3-позитивных ТК без признаков дегрануляции, уровнем базофилов (r=0,5667; p=0,0496), лактатом крови в первый день госпитализации (r=0,81; р=0,0486), ЧДД (r=0,58; p= 0,0003) накануне смерти, а также отрицательные связи с САД (r=-0,32; p=0,0469) в первый день госпитализации.

Корреляционный анализ не позволил определить значимых связей между исследуемыми протезами в тканях сердца, длительностью болезни COVID-19, длительностью госпитализации, наличием каких-либо сопутствующих заболеваний, а также процентом поражения легочной ткани по результатам компьютерной томографии.

Роль тучных клеток в реализации патогенетического каскада при COVID-19 осуществляется в различных аспектах. Инфильтрация легочной ткани ТК связана с развитием воспаления, легочного фиброза, тромбоэмболическими осложнениями и летальным исходом [12]. В данном случае индукция тромбообразования провоцируется активацией тромбоцитов и факторов свертывания, а формирование воспаления – рекрутингом и миграцией нейтрофилов, моноцитов, базофилов и эозинофилов, где ТК принимают активное участие. Аналогично этим данным, в представленном исследовании были установлены положительные связи между числом ТК и рядом воспалительных показателей. На активность воспалительного процесса также указывает преобладание ТК с признаками дегрануляции, что также соответствует данным об активации ТК и повышения дегрануляционной способности клеток под действием вируса SARS-CoV-2 [13].

Гипокалиемия является распространенным электролитным нарушением у пациентов с тяжелым течением COVID-19, вызванным, по всей видимости, усиленным калийурезом, а также потерями электролита через желудочно-кишечный тракт. Имеются данные о наличии обратных корреляционных связей между значениями калия крови и острофазовыми показателями среди пациентов, инфицированных SARS-CoV-2 [14]. Кроме того, усиление синтеза АТ II, наблюдаемое при COVID-19, а также при возрастании высвобождения химазы ТК, также сопровождается усилением выделения калия с мочой из-за увеличения выработки альдостерона. Однако, в представленном нами исследовании обратные связи были установлены между триптаза-позитивными ТК и калием крови, что, вероятно, может совокупно характеризовать изменения при системном воспалительном процессе.

Влияние гипоксии на состояние ТК выражается в снижении их дегрануляционной активности [15]. В приведенных нами данных усиление признаков нарастающей гипоксии (повышение ЧДД и лактата крови) было связано с повышением CPA3-позитивных ТК без признаков дегрануляции. Также в литературе имеются данные, в частности, о подавлении лактатом провоспалительной синтетической функции ТК [16].

Сообщалось, что инфицирование SARS-CoV-2 повышает риск формирования артериальной гипертензии [17]. Можно предположить, что данный процесс отчасти может быть опосредован влиянием ТК. Положительные связи между ТК и артериальным давлением могут возникать по причине выработки данными клетками в период активации ИЛ-6, который провоцирует развитие эндотелиальной дисфункции, а также образования АТ II, что наблюдается у индивидов с высокими значениями иммуноглобулина E [18].

Рекомендации по лечению COVID-19 включают антикоагулянтную терапию по причине высокого риска тромбоэмболических осложнений в данной когорте пациентов [19]. Результаты ретроспективных исследований указывают на улучшение прогнозов при назначении гепарина или низкомолекулярных гепаринов при данной патологии [20, 21]. Однако, помимо воздействия на систему гемостаза, гепарин способен связывать воспалительные цитокины, подавлять миграцию лейкоцитов, а также ингибировать гепариназу, которая, косвенно связана c повреждением эндотелия, развитием ОРДС и острого повреждения почек [22]. Кроме того, сообщалось, что гепарин является одним из ингибиторов высвобождения биологически активных веществ тучными клетками, что может объяснять более низкую активность дегрануляции химаза-позитивных ТК, а также общее количество химаза-позитивных ТК у пациентов, получавших терапию НФГ [23]. Истощение внутренних запасов синтезируемого ТК гепарина ассоциировано с неконтролируемым процессом высвобождения медиаторов воспаления в то время, как его введение в организм способствует нормализации и стабилизации ТК. Ожидаемо, сформированная отрицательная корреляционная связь между указанными популяциями ТК и назначением НФГ сочеталась с положительной корреляционной связью с АЧТВ, так как данный показатель коагулограммы повышается при назначении НФГ.

Назначение глюкокортикостероидов при COVID-19 продиктовано способностью этих препаратов подавлять активность как приобретенного, так и врожденного иммунитета, воздействуя на гуморальное и клеточное звенья [24]. Касаемо ТК, глюкокортикостероиды, а в частности дексаметазон, способны стабилизировать их мембрану и снижать активность [25]. Также было доказано подавление экспрессии рецепторов, с помощью которых SARS-CoV-2 проникает в клетки (ангиотензин-превращающего фермента 2 и трансмембранной сериновой протеазы 2-го типа), а также угнетение синтеза триптазы под действием терапии дексаметазоном [13].

Выводы. В проведенном исследовании показаны связи протеазной активности ТК различных фенотипов в тканях сердца с рядом исследуемых показателей у пациентов с COVID-19, в число которых входят маркеры воспаления, гипоксии и электролитных нарушений. Приведенные данные указывают на разнообразие механизмов вовлечения ТК сердца в системный патологический процесс при НКИ. Кроме того, в результатах исследования присутствуют свидетельства эффективности терапии дексаметазоном, НФГ и ингибиторами ИЛ-6 в данной когорте пациентов, обусловленное стабилизацией ТК и подавлением их дегрануляционной активности.